课题3　分解纤维素的微生物的分离ppt课件课堂实录

一、纤维素与纤维素酶（阅读教材P27～28）

1．纤维素

(1)化学本质：由C、H、O三种元素组成，基本组成单位是葡萄糖，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

(2)来源：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外木材、作物秸秆等也富含纤维素；纤维素是构成植物细胞壁的主要成分之一。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

(2)作用原理

(3)实验验证纤维素酶的作用

试管

滤纸条

1 cm×

6 cm 1 cm×

6 cm 缓冲液

pH＝4.8 10 mL 纤维素酶

(70～

80 U/mL) 1_mL

条件

结果

完全

分解

基本无

变化

1 2 11 mL / 将两支试管固定在50 mL 的锥形瓶中，在摇床上以

140 r/min的转速振荡反

应1 h

二、纤维素分解菌的筛选（阅读教材P28）

1．方法

2．原理

三、实验设计和操作（阅读教材P28～29）

1．土壤取样：选择富含纤维素的环境。

2．选择培养

(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

3．梯度稀释

4．涂布培养：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

5．筛选菌株：刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落。

四、课题延伸——纤维素分解菌的鉴定 （阅读教材P30）

1．为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

2．纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

[共研探究] 纤维素分子的结构如图所示，结合教材回答下列问题：

1．纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物

质。纤维素能被土壤中某些微生物产生的纤维素酶分解。

2．纤维素酶

(1)纤维素酶是一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

(2)纤维素酶作用过程

3．纤维素分解菌的筛选

(1)利用刚果红染色法筛选纤维素分解菌。

(2)纤维素分解菌的筛选常用的有两种方法，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

(3)刚果红染色法筛选的原理是什么？

(4)培养基中出现透明圈不一定是纤维素分解菌的作用，因为刚果红可与多糖类化合物产生红色复合物，若多糖为淀粉，产生淀粉酶的微生物也可使培养基产生透明圈。

[总结升华] 两种刚果红染色法的比较

项目

内容

方法一

培养基上长出菌落→覆盖质量浓

度为1 mg/mL的CR溶液――→

过程

倒去CR溶液→加入NaCl溶液

――→倒掉NaCl溶液→出现透

明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素

分解菌的作用

操作简便，不存在菌落混

杂问题

①由于琼脂、土豆汁中均含有

淀粉类物质，可能使产生淀粉

酶的微生物也形成透明圈，即

假阳性反应；②有些微生物具

有降解色素的能力，它们会降

解刚果红形成透明圈，与纤维

素分解菌不易区分

15 min10～15 min方法二

配制CR溶液→灭菌→按照

1 mL CR/200 mL培养基比例

混匀→倒平板→培养→出现

透明圈

缺点

制作繁琐，加入刚果红会

使菌落之间发生混杂

[对点演练] 1．下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是(

) A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．在菌落形成前倒平板时加入，刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

解析：选C

利用刚果红筛选纤维素分解菌时，刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。在细菌菌落形成前倒平板时加入，要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。

[共研探究] 1．实验流程

土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。

(1)涉及的生物技术

主要有培养基的制作、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取

样等。

(2)实验步骤剖析

①土壤取样

采取土样时，可以选择富含纤维素的环境。由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种环境中获得目的微生物的概率要高于普通环境。

②选择培养

a．目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。

b．操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

c．在分离分解纤维素的微生物的实验流程中，进行选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度；使能够适应人工设置的营养条件的微生物得到迅速地繁殖，而不适应的微生物的繁殖得到抑制。选择培养的环节是否需要设置，可根据样品中目的微生物数量的多少来确定。

③为什么对挑选产生透明圈的菌落作进一步的鉴定？

提示：产生透明圈的菌落可能是能产生淀粉酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。

2．两种培养基

纤维素分解菌的选择培养基配方1 纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

鉴别纤维素分解菌的培养基配方2 5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

CMC－Na 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL (1)功能方面：

①培养基配方1为纤维素分解菌的选择培养基，该培养基中的唯一碳源是纤维素粉，只有能利用它的纤维素分解菌才能生存。

②培养基配方2为纤维素分解菌的鉴别培养基。在该培养基中加入刚果红溶液，在该培养基上生长的纤维素分解菌分泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。

(2)物理性质方面：

①培养基配方1为纤维素分解菌的液体培养基，利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度。

②培养基配方2为纤维素分解菌的固体培养基，原因是添加了琼脂成分，可以在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

3．分解纤维素微生物的分离实验的三个易误点

(1)培养基的制作是否合格：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。

(2)选择培养基是否筛选出菌落：如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

(3)分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

[总结升华] 1．对纤维素分解菌筛选流程的说明

(1)为确定得到的细菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产生纤维素酶的实验。因为形成透明圈的菌落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌种。

(2)流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。

(3)本实验的流程与课题2的流程有一定的区别。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。

2．纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的比较

(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)纤维素分解菌的鉴别培养基为固体培养基，因为需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)在上述选择培养基中能以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；而在上述鉴别培养基中，绝大多数微生物都可以正常生长。

【易错易混】

判断某个选择培养基是否具有选择作用时，应设立基础培养基进行对照；若判断所使用

的培养基灭菌是否彻底，应设立不接菌种的该培养基进行空白对照。

[对点演练] 2．下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是(

) A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B．选择培养这一步可省略

C．经稀释涂布平板后，用刚果红对长出菌落的培养基染色

D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

解析：选A

经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释涂布平板后，用刚果红对长出菌落的培养基染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。

1．鉴定纤维素分解菌时，可以使用刚果红对其染色，刚果红染色法有两种常用方法，两种刚果红染色法的结果是(

) A．均会出现透明圈

B．方法一出现，方法二不出现

C．均不会出现透明圈

D．方法一不出现，方法二出现

解析：选A

两种刚果红染色法染色的时间不同，但结果一样，均出现透明圈。

2．下列为从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，其中正确的是(

) A．土壤取样→梯度稀释→选择培养→涂布平板→挑选菌落

B．土壤取样→选择培养→梯度稀→释涂布平板→挑选菌落

C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落

D．土壤取样→梯度稀释→涂布平板→选择培养→挑选菌落

解析：选B

正确的流程是“土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌落”，其中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，因此需要在稀释涂布平板之前进行，最后根据菌落的特征挑选纤维素分解菌。

3．纤维素分解菌的筛选原理是(

) A．刚果红可以与纤维素形成红色复合物

B．刚果红可以与水解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物

C．刚果红可以与纤维素酶形成红色复合物

D．刚果红可以与纤维素分解菌结合形成红色复合物

解析：选A

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖及葡萄糖发生这种反应，也不与纤维素酶或纤维素分解菌结合形成红色复合物。

4．生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙

醇，其技术流程为：纤维素酶解→酵母发酵→蒸馏→成品。获取纤维素酶的成本能否下降，是能否实现生物乙醇工业化生产的关键因素。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌的培养液中提取。某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌的实验流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→鉴别培养。

(1)最好选择怎样的环境采集土样？

_____________________________。

(2)以下是一种培养基的配方：纤维素粉5 g、NaNO3 1 g、Na2HPO4·7H2O 1.2 g、KH2PO4

0.9 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪素0.5 g(蒸馏水定容到1 000 mL)。该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原理是_________________________。

(3)为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基中加入________染液，将筛选获得的菌液稀释后用________法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生________的菌落作为菌种进行扩大培养。

(4)纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢？请设计实验进行检测。______________________________________。

解析：富含纤维素的土壤中，含有以纤维素为碳源的纤维素分解菌，且数量多。题目中纤维素为含纤维素酶的微生物提供碳源和能源，不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源而不能正常生长繁殖，因此该培养基具有选择作用。纤维素量一定，且时间一定时，纤维素酶产量与分解产生的葡萄糖数量成正比。

答案：(1)选择纤维素丰富的土壤环境

(2)培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌生长，同时抑制其他微生物生长

(3)刚果红

涂布平板

透明圈

(4)向定量纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素，定时测量葡萄糖产量的变化

【基础题组】

1．不能与刚果红反应生成红色复合物的是(

) A．纤维二糖

B．纤维素

C．CMC－Na

D．淀粉

解析：选A

刚果红可以与多糖物质形成红色复合物，但不与纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖等发生反应。

2．下列关于纤维素的叙述中，不正确的是(

) A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物

B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能产生纤维素酶

C．植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素

D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而为生物体提供能量

解析：选D

自然界中部分能够合成纤维素酶的生物才能分解纤维素。

3．微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(

) A．C1酶和CX酶

B．C1酶和葡萄糖苷酶

C．CX酶和葡萄糖苷酶

D．C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶

解析：选A

纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，其中C1酶和CX酶能将纤维素分解成纤维二糖，而葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。

4．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在(

)

A．加入指示剂的鉴别培养基上

B．含有蛋白胨的固体培养基上

C．只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上

D．含四大营养要素的培养基上

解析：选C

选择纤维素分解菌的培养基中应含有该种

菌生长发育所需的营养条件，且其他菌种在这种培养基中不能生存。

5．加工橘子罐头，采用酸碱处理脱去中果皮(橘络)，会产生严重污染。目前使用酶解法去除橘络，可减少污染。下列生长在特定环境中的4类微生物，不能产生所用酶的有(

) A．生长在麦麸上的黑曲霉

B．生长在酸奶中的乳酸菌

C．生长在棉籽壳上的平菇

D．生长在木屑上的木霉

解析：选B

橘络的主要成分是纤维素，用纤维素酶就可处理；A项中生长在麦麸上的黑曲霉，C项中生长在棉籽壳上的平菇，D项中生长在木屑上的木霉都生活在富含纤维素的环境中，都能产生纤维素酶。牛奶中不含纤维素，因此B项生长在酸奶中的乳酸菌不能产生纤维素酶。

6．[多选]为了从牛的瘤胃中分离出能够分解纤维素的微生物，下列实验操作及叙述不科学的是(

) A．在富含纤维素的培养基上长出的菌落即为纤维素分解菌

B．将培养基和实验器材进行严格的消毒灭菌

C．将提取的胃液进行系列稀释后接种培养

D．接种后在适宜温度和充足氧条件下培养

解析：选AD

纤维素分解菌在富含纤维素的培养基上能够形成生长优势，但并不是只有纤维素分解菌生长，因此需要用刚果红染色法进行鉴别培养，A项错误。牛胃的缺氧环境只允许厌氧型的纤维素分解菌生长，因此培养牛胃中的纤维素分解菌应提供适宜的温度和无氧环境，D项错误。培养基和实验器材消毒灭菌是为了防止杂菌污染，B项正确。为了得到单细胞菌落，提取的胃液需先进行系列稀释后接种培养，C项正确。

7．在分离分解纤维素的微生物实验中，关于土壤取样的叙述不正确的是(

) A．可选取深层的土壤作为样品

B．可选取树林中多年落叶形成的腐殖土作为样品

C．可选取树林中多年积累的枯枝败叶作为样品

D．可把滤纸埋在土壤中经过30天左右，再选取已烂的滤纸作为样品

解析：选A

深层土壤中纤维素含量少，纤维素分解菌的数量也少。

8．在分离纤维素分解菌过程中往往需要振荡，其作用不包括(

) A．使细菌能与培养基混合均匀

B．使细菌能充分吸收氧气

C．使细菌能快速繁殖

D．防止细菌失水

解析：选D

纤维素分解菌属好氧型细菌，充分振荡，一方面可促进细菌与培养基混合均匀，有利于其吸收营养，另一方面让细菌能充分与空气接触，有利于吸收氧气，以上两方面都能促进细菌快速繁殖。

【能力题组】

9．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选

择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

) A．伊红美蓝培养基、含青霉素培养基

B．含青霉素培养基、无机培养基

C．无机培养基、含青霉素培养基

D．含青霉素培养基、伊红美蓝培养基

解析：选B

酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用无机培养基可进行选择培养。

10．在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是(

) A．刚果红与纤维素形成的复合物

B．刚果红与纤维二糖形成的复合物

C．纤维素分解后形成的葡萄糖导致的

D．以纤维素分解菌为中心形成的

解析：选D

刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

11．使用刚果红染色时，加入刚果红应在(

) ①制备培养基时

②梯度稀释时

③倒平板时

④涂布时

⑤长出菌落时

A．①③

B．②⑤

C．③⑤

D．④⑤

解析：选C

常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，长出菌落后再加入刚果红进行颜色反应；另一种是倒平板时就加入刚果红。最终，两种染色法都可以在培养基上观察到以纤维素分解菌为中心的透明圈。

12．下列有关分解纤维素微生物的分离的叙述，不正确的是(

) A．纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵

B．对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后，无需再进行其他实验

C．纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定

D．纤维素酶是一种复合酶

解析：选B

初步筛选只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产生纤维素酶的实验。

13．现在大力提倡无纸化办公，但是仍然不可避免地每年要产生大量的废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源——乙醇。如图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工作流程，请回答相关问题：

(1)自然界中①环节需要的微生物大多分布在________的环境中。将从土壤中获得的微

生物培养在以______为唯一碳源、并加入__________的培养基上筛选周围有________的菌落。

(2)如上所述的筛选中获得了三个菌落，对它们分别培养，并完成环节②，且三种等量酶液中酶蛋白浓度相同，则你认为三种酶液的活性________(填“一定相同”“不一定相同”或“一定不同”)，可以通过________________________进行定量测定。

(3)①环节常选择木霉，②中获得的酶是________酶。该酶至少包括____________三个

组分。

(4)生产中可以满足④环节的常见菌种是________，为了确保获得产物乙醇，⑤环节要注意________，④过程要注意避免________。

解析：(1)从富含纤维素的环境中可以获得富含纤维素酶的微生物，这类微生物的纯化培养是在以纤维素为唯一碳源，并加入刚果红的培养基上筛选周围有透明圈的菌落而获得的。(2)由于三个菌落中的细菌数目可能不同或者产酶能力不同，从三个菌落中获得三种等量酶液中酶蛋白浓度相同，其活性也不一定相同；可以通过对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定来确定三种酶液的活性。(3)木霉中产生的纤维素酶包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶三个组分。(4)生产中获得乙醇的常见菌种是酵母菌，酵母菌在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精，因此生产中注意保证无氧条件，还要注意避免杂菌的污染。

答案：(1)富含纤维素(其他答案合理也可，如落叶较多等)

纤维素

刚果红

透明圈

(2)不一定相同

对纤维素酶催化纤维素分解后所产生的葡萄糖

(3)纤维素

C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶

(4)酵母菌

发酵装置密闭(或保证无氧条件等)

杂菌污染

14．有些微生物含有纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。纤维素酶可以通过微生物进行发酵生产，为了提高酶的产量，请你设计一个实验，利用诱变育种的方法，获得产生纤维素酶较多的菌株。

(1)写出实验步骤：

第一步：将培养好的生产菌株分成A、B两组，___________________________，B组不作处理。

第二步：制备含有____________的固体培养基。

第三步：把A组的大量菌株接种到多个含有___________________的固体培养基上，同时接种__________________________，把它们置于相同的条件下培养。

第四步：一段时间后，取培养基用________染色，观察记录_________________。

(2)预期实验结果及结论：

a．A组中菌落周围的透明圈与B组相比较大，说明

__________________________。

b．______________________________________________________________________。

c．______________________________________________________________________，

说明诱变育种获得了低纤维素酶产量的菌种。

(3)若要获得纯净的高产菌株，需进行________________或__________________操作。

解析：(1)要得到高产纤维素酶的菌株，必须先进行诱变处理，而突变是不定向的，所以要经过筛选。设计实验要遵循对照原则和单一变量原则。实验分两组，实验组用诱变剂处理，对照组不作处理。要检测纤维素分解菌产纤维素酶的能力，应用含纤维素的鉴别培养基，根据形成的透明圈的大小，来判断产纤维素酶能力的高低。整个过程中，注意对照组和实验组的其他条件应完全相同。(2)预期实验结果，诱变组和对照组相比，透明圈大小可能相同，可能较大，可能较小，所以需要分情况讨论，当然，真正想得到的是透明圈较大的菌株，即产纤维素酶能力强的菌株。(3)一般初次分离得到的都不是纯净的细菌，需进一步纯化培养，可通过平板划线法或稀释涂布平板法进行纯化培养。

答案：(1)A组用一定剂量的诱变剂处理

纤维素

纤维素

B组(未处理)的菌株

刚果红

菌落周围透明圈的大小情况

(2)a.诱变育种获得了纤维素酶产量高的菌种

b．A组中菌落周围的透明圈与B组相同，说明诱变育种没有使菌株发生变化

c．A组中菌落周围的透明圈与B组相比较小

(3)平板划线

稀释涂布平板

15.一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。

(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行________处理。

(2)要在长期使用该除草剂的土壤中分离出目的菌，从物理性质、用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是________________________________。

(3)在划线培养时，只有很少的菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是_______________________________或有氧条件抑制了这些细菌的生长。

(4)在固体培养基上形成的菌落中，无透明圈菌落利用的氮源主要是________，有透明圈菌落利用的氮源主要是____，据此可筛选出目的菌。实验结果如图，A～E五种菌株中，________是最理想菌株。

(5)科研人员用射线处理该细菌获得两个突变株M和N，然后对突变株M和N进行实验，结果如表所示：

接种的菌种

M N M＋N 一般培养基

不生长

不生长

能生长

实验处理及结果

添加营养物质甲，能生长

添加营养物质乙，能生长

不添加营养物质甲、乙，都能生长

突变株M不能在一般培养基上生长的原因是________________________。突变株M和N混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是___________________________。

解析：(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。(2)从物理性质方面来看，题图中的培养基属于固体培养基；从用途方面来看，该培养基属于选择培养基。该除草剂为含氮有机化合物，降解该除草剂的细菌可以该除草剂为氮源。故该培养基中除加入除草剂外，不能再含有其他氮源，以选择出能降解该除草剂的细菌。(3)在以该除草剂为唯一氮源的培养基上，不能降解该除草剂的细菌(除具有固氮能力的细菌外)是不能生长的。(4)含一定量该除草剂的培养基不透明，形成透明圈是该除草剂被某些细菌降解的结果。(5)突变株M的生长依赖于营养物质甲，突变株N的生长依赖于营养物质乙。不添加营养物质甲和乙，二者混合培养时都能生长，最可能的原因是突变株M为突变株N提供了营养物质乙，突变株N为突变株M提供了营养物质甲。

答案：(1)稀释

(2)在无氮固体培养基中添加了该除草剂

(3)培养基中缺少这些细菌可利用的氮源

(4)氮气

该除草剂

E

(5)突变株M缺乏合成营养物质甲所需要的酶

突变株M生长需要营养物质甲，突变株N可以提供；突变株N生长需要营养物质乙，突变株M可以提供