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课题3

分解纤维素的微生物的分离

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1.结合教材P27“基础知识”，掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。2.阅读教材P28“实验设计”，理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。3.阅读教材P30“课题延伸”，掌握纤维素酶的测定方法。

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1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。

一、纤维素分解菌的筛选

基础梳理

1.纤维素与纤维素酶

(1)纤维素：下图所示为纤维素的结构式。

①基本组成单位：葡萄糖。

②分布：主要分布在植物根、茎、叶等器官的细胞壁。

(2)纤维素酶

①组成：是一种复合酶，至少包括三种酶，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

C1酶和CX酶葡萄糖苷酶②作用：纤维素―――――――→纤维二糖―――――――→葡萄糖

2.纤维素分解菌的筛选

(1)方法：刚果红染色法。

①方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。

②方法二：在倒平板时就加入刚果红。

(2)原理

纤维素＋刚果红→红色复合物

↓纤维素酶

纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物

↓

以纤维素分解菌为中心的透明圈

互动探究

1.分析教材P29“纤维素分解菌的选择培养基配方”，回答下列问题：

(1)此配方是液体培养基还是固体培养基？为什么选择此类培养基？

答案

此配方是液体培养基，因为配方中无凝固剂。液体培养基与微生物的接触更充分，微生物更容易从培养基中获得营养物质，因此可以快速增加微生物的浓度。

(2)这个选择培养基对微生物是否具有选择作用？怎样设计对照实验证明你的观点？

答案

有选择作用。本配方中富含纤维素，更适合能够分解纤维素的微生物大量繁殖。对照实验可以用牛肉膏蛋白胨培养基培养微生物。若选择培养基上微生物数量明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上微生物的数量，则说明培养基起到了选择作用。

活学活用

1.下列关于纤维素酶的叙述中，错误的是(

) A.纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖

B.纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分

C.纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质

D.分解纤维素的细菌、真菌和放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的

答案

A 解析

纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分——C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和CX酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。

2.分析下表培养基的配方，请回答下面的问题：

纤维素分解菌的选择培养基

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。

(1)此培养基配方中为微生物提供碳源的主要是__________、氮源是________________。

(2)此配方为__________培养基(根据物理状态)配方。

含量

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g

(3)此培养基选择出的微生物主要是____________________________________________。

问题导析

(1)该培养基中纤维素是主要的碳源，所以可以用于筛选纤维素分解菌。

(2)由于该培养基中没有加入琼脂，所以为液体培养基。液体培养基中微生物与营养成分的接触更充分，可以提高微生物的代谢效率。

答案

(1)纤维素粉

NaNO3、酵母膏、水解酪素

(2)液体

(3)纤维素分解菌

解析

该培养基的主要碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏、水解酪素。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为主要碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。

二、尝试从土壤中分离出分解纤维素的微生物

基础梳理

1.实验流程

土壤取样：选择富含纤维素的环境

↓

选择培养：用富含纤维素的选择培养基扩大培养

↓

梯度稀释：依次稀释101～106倍

↓

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落

2.实验操作注意事项

(1)土壤取样时要选择富含纤维素的环境。

(2)选择培养的方法：用富含纤维素的选择培养基。

目的：增加纤维素分解菌的浓度。

(3)梯度稀释的目的：能获得单个菌落。

(4)涂布平板时要选择鉴别纤维素分解菌的培养基。

(5)挑选产生透明圈的菌落。

3.菌种的进一步鉴定

(1)鉴定原理：为确定透明圈内的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验。

(2)发酵方法：有液体发酵和固体发酵两种。

(3)纤维素酶的测定方法：一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

互动探究

1.鉴别方法——刚果红染色法

比较项目

方法一

先培养微生物，再加入刚果红

显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂

方法二

在倒平板时加入刚果红

操作简单，不存在菌落混杂

有些微生物会降解刚果红，形成透明圈，与纤维素分解菌相混

优点

缺点

2.透明圈的形成

(1)对分离的纤维素分解菌作进一步的鉴定的原因是什么？

答案

产生透明圈的菌落可能是能产生纤维素酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。

(2)简要概述筛选纤维素分解菌时透明圈是如何形成的。

答案

纤维素分解菌分解纤维素产生的纤维二糖和葡萄糖，不能与刚果红形成红色复合物，而出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

(3)向含有分解尿素的细菌的培养基中加入酚红指示剂，会出现类似的圈吗？

答案

分解尿素的细菌能够将尿素分解成氨，加入酚红指示剂后会变红，也会形成以尿素分解菌为中心的红色的圈。

活学活用

3.研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物，请就如何从土壤中获得纤维素分解菌回答以下问题：

(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和_____酶。

(2)为获得纯净的菌株，常采用平板划线法进行接种，此过程所用的接种工具是________，操作时采用________灭菌的方法。

(3)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与____________和________发生这种反应。常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在________时就加入刚果红。

(4)如果观察到产生__________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行______________的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。

答案

(1)葡萄糖苷

(2)接种环

灼烧

(3)纤维二糖

葡萄糖

倒平板

(4)透明圈

发酵产纤维素酶

葡萄糖

解析

(1)纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)常用的接种工具是接

种环，操作时采用灼烧的方法灭菌。(3)刚果红不与纤维二糖和葡萄糖发生反应。(4)刚果红与纤维素反应呈红色，纤维素分解菌产生的纤维素酶会将纤维素分解而不能与刚果红染液反应呈红色，在菌落周围会出现透明圈。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

学习小结