复习与测试教学设计及教案分析

专题5 DNA和蛋白质技术导学案

课题3 血红蛋白的粗提取和分离

1.实验原理

蛋白质的分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的＿＿＿＿＿＿＿＿＿、所带电荷的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿等等，可以用来分离不同蛋白质。

（1）凝胶色谱法（也称＿＿＿＿＿＿＿＿＿）

①概念：根据被分离蛋白质的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。

②原理：凝胶实际上是一些由＿＿＿＿＿＿＿构成的多孔球体，当不同的蛋白质通过凝胶时，＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程＿＿＿，移动速度＿＿＿，而＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在＿＿＿＿＿移动，路程＿＿＿＿，移动速度＿＿＿＿，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

（2）缓冲溶液

①概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液＿＿＿＿＿发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

②作用：能够抵制＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿对溶液的＿＿＿＿的影响，维持＿＿＿基本不变。

③缓冲溶液的配制：通常由＿＿＿种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的＿＿＿＿就可以制得＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿使用的缓冲液。

（3）电泳

①概念：指＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿在＿＿＿＿＿作用下发生迁移的过程。

②原理：许多重要的生物大分子，如＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿等都具有＿＿＿＿＿＿＿＿，在＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿下，这些基团会带上＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷＿＿＿＿＿的电极移动。

③作用：电泳利用了待分离样品中各种分子＿＿＿＿＿＿＿＿＿以及分子本身的＿＿＿、＿＿＿的不同，使带电分子产生不同的＿＿＿＿＿＿＿，从而实现样品中各种分子的分离。

④方法分类：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿电泳；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿电泳

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿以及＿＿＿＿＿＿＿等因素。测定蛋白质相对分子质量通常用＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

2.实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿。

（1）样品（哺乳动物的血液）处理和粗分离

①红细胞的洗涤：目的：去除＿＿＿＿＿；方法：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿离心

②血红蛋白的释放：加＿＿＿＿（低渗溶液，使红细胞吸水涨破）和＿＿＿＿（溶解细胞膜）

，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白。

③分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液从上往下分为4层: 第1层（最上层）：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的甲苯层

第2层（中上层）：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的沉淀层，＿＿＿＿＿色薄层固体

第3层（中下层）：＿＿＿＿＿的水溶液层，＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的液体

第4层（最下层）：其它杂质的＿＿＿＿＿沉淀层

将试管中的液体用＿＿＿＿＿过滤、除去＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，于＿＿＿＿＿中静置片刻后，分离出下层的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

④粗分离：即＿＿＿＿＿。将装有血红蛋白溶液的透析袋放入pH为7.0的磷酸缓冲液中，透析12h，以＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（2）纯化——凝胶色谱操作

通过凝胶色谱柱将＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿除去。

①制作＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

②装填＿＿＿＿＿＿。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算＿＿＿＿＿＿＿。在装填凝胶柱时，不得有＿＿＿＿存在。

③样品的加入和洗脱

（3）纯度鉴定：

判断＿＿＿＿＿的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

3.

操作提示

（1）红细胞的洗涤：＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿与＿＿＿＿＿＿＿十分重要。＿＿＿＿＿＿＿＿过少，无法除去血浆蛋白；＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿过高和＿＿＿＿＿＿＿＿过长会使＿＿＿＿＿＿＿＿等一同沉淀，达不到分离效果。

（2）色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿中膨胀，可以将加入其中的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿用＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿加热，加速膨胀。

（3）凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，降低＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（4）蛋白质的分离：如果红色区带＿＿＿＿＿＿＿＿＿地移动，说明色谱柱制作成功。

4.

实验结果分析与评价

（1）观察血液样品离心后是否分层。如果分层不明显，可能是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到＿＿＿＿＿的红细胞，影响后续＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（2）如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿有关。