课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件配套教案内容

生物高二年级人教2004课标版选修一专题2 课题2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计

一、教学目标

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

二、教学重难点

重点：对土样的选取和选择培养基的配制

难点：对分解尿素的细菌的计数

三、教学方法

实验探究、设疑启发、对比归纳

四、教具准备

多媒体、学案

五、教学过程

一、培养基与无菌技术

教

学

过

程

1.

培养基：

（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质。

（2）营养构成：水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。

碳源：有机碳源：葡糖糖、淀粉等（利用有机碳源为异养型）

无机碳源：二氧化碳、碳酸氢钠等（利用无机碳源为自养型）

氮源：有机氮源：牛肉膏、蛋白胨（主要为微生物提供糖、维生素和有机氮等营养物质）

无机氮源：氮气（蓝藻）、氨气（硝化细菌）、铵根、硝酸根（植物）

生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。（培养基的其他成分可能含有，不一定要额外加）。

例：培养乳酸杆菌时需要添加

维生素，培养霉菌时需要将培养基pH调节为

酸性

，培养细菌时需要将pH调节为

中性或微碱性。

拓展：根据代谢方式分类

（3）制备步骤：计算--称量--溶化--灭菌--倒平板。

注意事项：倒平板要在50摄氏度（手可以接受的温度）。

（4）类型：根据物理性质可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基。

划分标准

培养基种类

特点

用途

物

液体培养基

不加凝固剂

工业生产

理

半固体培养基

观察微生物的运动、分类鉴加凝固剂，如琼脂

性

定

质

固体培养基

微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

化

天然培养基

含化学成分不明确的天然物工业生产（例蘑菇生产）

学

质

成

合成培养基

培养基成分明确

分类、鉴别

分

在培养基中加入某种化学物培养、分离出特定微生物

质，以抑制不需要的微生物用

选择培养基

的生长，促进所需要的微生

物的生长

在培养基中加入某种指示剂鉴别不同种类微生物

途

或化学药品，用以鉴别不同鉴别培养基

种类的微生物

2.选择培养基和鉴别培养基的应用实例

1.尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2

，这是因为细菌能合成

脲酶

。

2.科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

类型

选择

培养基

实例

培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌（抗生素可以抑制肽聚糖的合成，而不能抑制几丁质的合成）

培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄糖球菌

以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌

不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物

石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物

鉴别

培养基

伊红--美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈深紫色并带金属光泽）

3.无菌培养

目的：防止外来杂菌的入侵。

无菌技术包括：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；

（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；

（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。

方法：(日常生活经常用到的是煮沸消毒法) 类型

方法

对象

消毒

巴氏消毒

紫外线（杀死蛋白和DNA）

化学药剂（如酒精）

灼烧灭菌

牛奶等不耐高温液体

接种室、接种箱或超净工作台

操作者双手

接种针（环）

玻璃器皿（如培养皿）和金属用具等

培养基

比较消毒和灭菌

灭菌

干热灭菌

高压蒸汽灭菌

比较项

消毒

灭菌

理化因素的作用强度

较为温和

强烈

消灭微生物的数量

部分生活状态的微生物

全部微生物

芽孢和孢子能否被消灭

不能

能

注意事项：（1）无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是防止感染实验操作者。

（2）对接种环灭菌时要用酒精灯的充分燃烧层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。

（3）利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热空气流通。

（3）物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高；随后关闭排气阀继续加热，气压升至

100k Pa，温度为121℃，并维持15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸。

（4）化学药剂的消毒方法，其作用原理使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过芽孢或孢子的坚硬外层进入细胞内，因此化学药剂消毒方法难以消灭孢子和芽孢。

（5）体积百分之70%的乙醇杀菌效果最强，浓度过低，杀菌力弱，浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，因此杀菌效果受影响。

二、纯化大肠杆菌的无菌操作和菌种保存

1.大肠杆菌：

（1）特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌

（2）用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具

2.牛肉膏蛋白胨固体培养基：

培养基的配制原则：

①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。

②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。

③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。

实验操作：

2．1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。

2．2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。

2．3 溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

2．4 调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。

2．5 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。

2．6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。

其过程是：

①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；

②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；

③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。

④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置（防止水分倒流污染培养皿）。

〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。

〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。

〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？

不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。

〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。

3.纯化大肠杆菌

2．7 接种

2．7．1微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。

2．7．2平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：

①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。

②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。

③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。

④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。

⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。

⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。

⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。

⑧将平板倒置放在培养箱中培养。

〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。

2．7．3

稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。

2．7．4

系列稀释操作：

①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号10、10、10、10、10、10。

②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。

122③从10倍液中吸取1mL菌液注入到编号为10试管内吹打均匀，获得10倍液。依此类推。

〖思考8〗操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。

3．1

培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。

3．2

在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

3．3

培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。

〖思考9〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。

〖思考10〗频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。

练习：

例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是

A.是碳源的物质不可能同时是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的无机物只提供无机盐

D.无机氮源也能提供能量

解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选123456

项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHC O3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。

答案：D

例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是

A.防止杂菌污染

B.消灭杂菌

C.培养基和发酵设备都必须灭菌

D.灭菌必须在接种前

解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。

答案：B

课堂总结、点评

实例探究

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是

A．在液体培养基上进行

B．至少接种一种细菌

C．接种一个细菌

D．及时补充消耗的营养物质

解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。

答案：A

例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是

A．调整期

B．对数期

C．稳定期

D．衰亡期

解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。

答案：C

例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。

⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是

，青霉素是青霉菌的

代谢产物。

⑵在生产和科研中，常选用处于

期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，

和

比较稳定。

⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，

，再计算发酵罐中菌体的总重量。

解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。

答案：⑴异养需氧型

次级

⑵对数

个体的形态生理特性

⑶称菌体的湿重（称烘干后的重量）

巩固练习

1．在一个“淀粉—琼脂”培养基的5个圆点位置，分别用不同方法处理，将此实验装置放在37℃恒温箱中，保温处理24h后，将碘液滴在培养基的5个圆点上，其实验结果记录于下表：（C）

淀粉圆点

①

②

③

④

⑤

实验处理方法

新鲜唾液与盐酸混合

经过煮沸的新鲜唾液

接种面包霉

只有新鲜的唾液

只有一定浓度的蔗糖溶液

碘液处理后的颜色反应

蓝黑色

蓝黑色

棕黄色

？

？

请指出④和⑤所发生的颜色反应，以及③接种的面包霉的分泌物分别是（

）

A．棕黄色、棕黄色、淀粉酶

B.蓝黑色、棕黄色、麦芽糖酶

C．棕黄色、蓝黑色、淀粉酶

D.棕黄色、蓝黑色、麦芽糖酶

2．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是

A．链霉素能阻止结核菌的生长

B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效

C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效

D．链霉素可以用于治疗伤寒病人

3.利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是（

）

A．酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌

B．酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌

C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳酸菌

D．黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌

4．下列操作不属于微生物的分离步骤的是（

）

A．

稀释

B．划线或涂布

C．接斜面

D．培养

5．影响微生物生长的主要环境因素是（

）

A．阳光、温度、水分

B．温度、水分、PH

C．水分、PH、氧

D．温度、PH、氧

6.下列微生物的产物中没有菌种特异性的一组是（

）

A．氨基酸、核苷酸、多糖、色素

B. 多糖、脂类、维生素、抗生素、氨基酸

C．核苷酸、多糖、维生素、毒素、抗生素

D．核苷酸、维生素、多糖、脂类、氨基酸

7．微生物代谢的人工控制是指（

）

A.改变微生物的遗传特性

B.控制发酵时的温度

C.调节发酵过程中的pH，氧气通入量

D.包括A、B、C三项

8．在微生物群体生长规律的测定中，不可能发生的是（

）

A.繁殖

B.生存斗争

C.种间斗争

D.种内斗争

9．与调整期长短有关的因素中，可缩短调整期的一组是（

）

①用与菌种相同的培养基

②营养丰富的培养基

③稳定期获得的菌种

④对数期获得的菌种

⑤接种时间提前

⑥接种量加大

⑦接种量减小

⑧接种种类加大

A、①③⑤⑦

B、②③⑤⑦

C、①④⑥

D、②④⑤⑥⑧

10．微生物群体生长善的测定方法可以是（

）

①测定样品的细胞数目

②测定次级代谢产物的总产量

③测定培养基中细菌的体积

④测定样品的细胞重量

⑤测定初级代谢产物的总产量

A.②④

B.①④

C.①③⑤

D.②③④

答案：1—5 CDCCD

6—10 DDCCB

作

业

教

学

后

记