课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课教案整理

第2讲

微生物的利用

2.某种微生物数量的测定C3.微生物的应用B[思维导图·成一统] 1.微生物的分离和培养知识要求B、实验要求b

[基础速练·固根基] 1．判断下列叙述的正误

(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐(√) (2)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及微生物对特殊营养物质的需求(√) (3)培养基分装到培养皿后才能进行灭菌 (×) (4)消毒的原则是既能杀死材料表面的微生物，又要减少消毒剂对细胞的伤害(√) (5)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌(×) (6)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧(√) (7)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就可在培养基表面形成单个菌落(√) 2．据倒平板的操作图示填空

(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：

丙→乙→甲→丁。

(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。

(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。

3．据微生物接种后培养的效果图回答问题

(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？

提示：获得效果A的接种方法为稀释涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。

(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？

提示：最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。

[题组练透·过考点] 题组一

培养基的成分、功能及其制备

1．下列关于制备牛肉膏蛋白胨培养基的叙述，错误的是(

) A．培养基应先调pH再进行灭菌

B．培养基应先灭菌再分装到培养皿

C．溶化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦

D．高压蒸汽灭菌锅加盖时应按顺时针方向依次旋紧螺栓

解析：选D

制备培养基灭菌时，培养基应该先调节pH后灭菌。培养基在分装到培养皿之前要先进行灭菌处理，以防止杂菌的污染。溶化琼脂时要用玻璃棒搅拌，防止琼脂烧焦，搅拌的过程不能让琼脂溢出。高压蒸汽灭菌锅加盖时要以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，而不是依次旋紧。

2．(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内

的葡萄糖的主要作用是______________________________________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。

解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基是只允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO4/HPO24可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。

－－答案：(1)脲酶

分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物

为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

(2)尿素

其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

[归纳拓展]

培养基的配制、成分确定及种类

(1)培养基的配制原则：

①目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。

②营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。

③pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。

(2)培养基中营养物质的确定方法：

不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。如：

①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。

②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物(即碳源)，必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。

(3)培养基的分类：

①按物理状态分类：

培养基种类

液体培养基

半固体

培养基

固体培养基

②按功能分类：

种类

特点

不加凝固剂

加凝固剂(如琼脂) 加凝固剂(如琼脂) 用途

工业生产

观察微生物的运动、分类

鉴定

微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏

制备方法

原理

依据某些微生物用途

从众多微生物中分离所需的微生物

举例

加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌

选择培

养基

培养基中加入某些化学物质

对某些物质的特殊需求或抗性而设计

鉴别培

养基

培养基中加入某种指示剂或化学药品

产生特定的颜色或其他变化

鉴别不同种类的微生物

(4)培养基制备中倒平板的注意事项：

①培养基需冷却至50 ℃时开始倒平板，原因是：琼脂是一种多糖，在98 ℃以上溶化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。

②需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

③平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能用来培养微生物。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

题组二

无菌技术的操作

3．下列操作必需在严格无菌条件下进行的是(

) A．称量牛肉膏蛋白胨培养基的各种成分

B．利用平板划线法接种大肠杆菌

C．用酒精擦拭双手

D．溶化牛肉膏蛋白胨培养基的各种成分

解析：选B

称量牛肉膏蛋白胨培养基的各种成分要求清洁和消毒；利用平板划线法

接种大肠杆菌必需在严格无菌条件下进行，否则混入杂菌，不能提取到目的菌；用酒精擦拭双手为清洁和消毒；配制好的培养基还要进行灭菌，故溶化牛肉膏蛋白胨培养基的各种成分无需灭菌。

4．(2014·江苏高考节选)为了获得β­胡萝卜素产品，某小组开展了产β­胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。请回答下列问题：

(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是______________________________________ ____________________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该_________________。

(2)为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是______________。

(3)右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是________(填序号)。

①安全阀、放气阀、压力表

②放气阀、安全阀、压力表

③安全阀、放气阀、温度表

④放气阀、安全阀、温度表

(4)为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是____________________________________。

解析：(1)实验室常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)，在实验前应用牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。(2)酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑制细菌、放线菌的生长。(3)图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。(4)该接种过程中的3块平板相同，菌种来源相同，只有一块平板接种培养后无菌落，对比知，问题出现在接种过程中，最可能的原因是接种环灼烧后未充分冷却，菌种被杀死。

答案：(1)干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)

用牛皮纸(报纸)包扎器皿

(2)抑制细菌(放线菌)的生长 (3)①

(4)接种环温度过高，菌种被杀死

[归纳拓展] 1．消毒和灭菌的比较

项目

条件

结果

常用

方法

消毒

较为温和的物理或化学方法

仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸

消毒法

100 ℃

操作

方法

煮沸

5～6 min 巴氏

消毒法

80 ℃煮

15 min 或在

70～75 ℃

化学药剂

消毒法

70%酒

精、氯气

等

灼烧

灭菌法

酒精灯

火焰的

外焰

灭菌

强烈的理化因素

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

干热

灭菌法

干热灭菌

箱，160～

170 ℃，维

高压蒸汽

灭菌法

高压蒸汽

灭菌锅，恒

温

煮30 min 持1～2 h 121 ℃，

维持15～

30 min

应用

范围

日常

用品

不耐高

温的液

体

用酒精擦

拭双手，

用氯气消

毒水源

接种

工具

玻璃器皿、金属工具

培养基

及容器

的灭菌

2.高压蒸汽灭菌锅的使用注意事项

(1)首先向灭菌锅内加入适量的水。

(2)装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。锥形瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹瓶口的纸而透入棉塞。

(3)拧紧固定盖子的螺栓，注意要同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，不漏气。

(4)加热灭菌锅，打开排气阀，使水沸腾，排除锅内的冷空气。等冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐步上升。

(5)到灭菌时间后，切断热源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降到零时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

题组三

微生物的培养与纯化

5．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。

(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

(3)右图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。

(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为___________________________________________________________ ________________________。

管号

苯酚浓度(mg/L) 1

2

3

4

5

6 1 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释____________(填序号：①5

②10

③20)倍后，再进行比色。

解析：(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加琼脂作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。

答案：(1)蛋白胨、苯酚

(2)增加

稀释涂布

凝固剂(琼脂)

(3)③

(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8

③

[归纳拓展]

纯化微生物的接种方法

(1)平板划线法和稀释涂布平板法的比较：

项目

关键操作

注意

事项

菌体

获取

适用

范围

优点

缺点

平板划线法

接种环在固体平板培养基表面连续划线

每次划线前后均需灼烧接种环

在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体

适用于好氧菌

可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落

不能对微生物计数

稀释涂布平板法

①一系列的梯度稀释

②涂布平板法操作

稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围

从适宜的稀释度的平板上的菌落中挑取菌体

适用于厌氧菌和兼性厌氧菌

既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数

操作复杂，需要涂布多个平板

(2)平板划线操作的注意事项：

①灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

②第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

③划线时最后一区不要与第一区相连。

④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。

⑤操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：

第一次操作

每次划线之前

杀死上次划线后接种环上杀死接种环上原有的微生物

残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少

杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者

划线结束

目的