课题3　血红蛋白的提取和分离ppt配用优秀获奖教案

血红蛋白的提取与分离

一、蛋白质

1、物理性质

（1）溶解性：有的蛋白质能够在水里形成溶液（如鸡蛋白）蛋白质分子的直径在10-9 ~10-7m（胶体微粒都大小）所以蛋白质具有胶体的性质

（2）盐析：蛋白质溶液中加入少量电解质（NaCl、NaSO4、（NH4)2SO4）能促进蛋白质溶解；如果想溶液中加入高浓度的电解质溶液，可以使蛋白质从溶液中析出，而出现盐析想象，盐析得到的蛋白质仍可溶于水，而不影响其原来的理化性质，这一过程是可逆的，借助这一原理，可以采用盐析的方法分离提纯蛋白质

（3）变性：在高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线照射的条件下，蛋白质的结构可发生不可逆的改变，这种变化称为蛋白质的变性，蛋白质变性凝固后失去原有理化性质和生理作用也称失活

2、化学性质

（1）具有酸碱两性：蛋白质由α—氨基酸通过肽键形成的高分子化合物，在肽链的两端分别有一个—NH3和—COOH，因此蛋白质的性质同氨基酸一致，也分别显示了—NH3的碱性和—COOH的酸性，具有酸碱两性

（2）水解反应：在一定浓度的酸、碱溶液中或在蛋白酶的催化作用下，蛋白质可水解为小分子的多肽或多种氨基酸，该过程有水参与

（3）颜色反应：蛋白质可以跟许多试剂发生颜色反应，如蛋白质中的肽键可以跟肽键发生双缩脲反应；蛋白质溶液中滴加高浓度HNO3，可以使溶液呈现黄色的颜色反应

（4）氧化反应：蛋白质在灼烧时，可以发生氧化分解，产生有灼烧羽毛气味的气体，也可以借此来鉴定蛋白质

二、血液

水分

液体成分（血浆5%）

血浆蛋白

固体物质

无机盐

磷脂

血液

葡萄糖

白细胞

有形成分（45）

血小板

红细胞：血红蛋白

两个α肽链

球蛋白

血红蛋白

两个β肽链

四个亚铁蛋白血红素基团（能结合4个O2分子或4个CO2分子）血红蛋白因

含有血红素而呈现红色

三、凝胶色谱法

1、概念：凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据相对分子质量的大小，分离蛋白质的有效方法

2、原理：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，由多糖化合物构成，在小球内部有许多贯通的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶色谱法时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动速度慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法通过凝胶内

部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动较快（这种现象称为分子筛选）相对分子不同的蛋白质得以分离

3、凝胶色谱柱的组成

凝胶色谱柱由溶积柱、多孔板和凝胶颗粒组成。多孔板网孔大小决定

了分离蛋白质的相对分子质量范围

4、凝胶的种类

（1）交联葡聚糖凝胶

交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200为每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分布范围。

Sephadex G—75每克凝胶膨胀吸水7.5g （2）琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链和氢键来维持网状结构，网状结构的疏密程度依靠琼脂糖的浓度，一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水、PH为4 ~ 9范围内的盐溶液）琼脂糖凝胶在40℃以上开始熔化，不能高压灭菌，可用化学灭菌法处理

（3）聚丙烯酰胺凝胶

是一种人工合成凝胶，有聚丙烯酰胺单体和N、N—亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下，聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶，经干燥粉粹或加工制成颗粒，控制交联剂的使用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带电荷的多少及分子的大小、形状

（4）聚苯乙烯凝胶

具有大网孔结构，可用于分离分子量为1600到40000000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物质的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜

（1）制作凝胶色谱柱

①取长40cm内径为1.6cm的玻璃管，两端需要用砂纸磨平，直径的大小不影响分离效果，但直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此选择的直径不超过2cm的色谱柱

②底塞的制作

打孔

→

挖出凹穴

→

安装移液管头部

→

覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱布包好

③顶塞大的制作

打孔

→

安装玻璃管

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体

⑤安装其他附属结构

（2）凝胶色谱柱的装填（本实验使用交联葡聚糖凝胶）

①固定：将色谱柱垂直固定在支架上

②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀

（凝胶颗粒必须在蒸馏水或洗脱瓶中膨胀，也可采用沸水浴加热，加入洗脱液的湿凝胶，既可使凝胶快速膨胀，又可以杀死微生物，排除凝胶中的空气）

③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h 判断装填的凝胶色谱柱成功与否

①在凝胶柱旁放一支与凝胶快速垂直的日光灯，检查凝胶是否装填均匀

（1）方法：

②加入大分子的有色物质，观察色带移动情况

（2）成功与否的标准及调整：若色素带均匀、狭窄、平整，说明性能良好；若色谱柱内出现纹路或气泡，可轻轻敲柱体消除气泡，若消除不了，则重新装填

（3）需要重新装填

②色谱柱内有气泡，一旦发现有气泡，必须重新装填

原因：气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱顺序，降低分离效果

③若分离过程中红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功

四、电泳

1、定义：

电泳指带电粒子在电场的作用下，发生迁移的过程，在确定条件下带电粒子在单位电场强度下、单位时间内移动的距离为常数，不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同，但电荷性质不同，在同一电场中分开的距离与外加电场、电泳时间成正比

2、原理

生物体内有许多重要的生物大分子，如多肽、核酸都具有可解离的基团，在一定PH下，这些基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷相反的电极方向移动，电泳利用了分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使不同带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种组分的分离。一般来说带电颗粒的直径越小、颗粒越接近球形、所带电荷越多，则在电场中泳动速度越快，反之越慢。此外电场强度、溶液的PH等因素对泳动速度也有影响

3、常用的电泳方法

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺电泳（SDS）

（1）琼脂糖凝胶电泳

天然琼脂是一种多聚糖，主要由于琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷；而琼脂胶是一种含硫酸很和羧基的强酸性糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电泳现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：

①琼脂凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要先处理就可以进行电泳

②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98% ~ 99%），近似自由电泳，样品扩散较自由，电流对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好

③琼脂糖透明，无紫外线吸收，电泳过程和结果可直接用紫外灯检测及定量测定

④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜后可长期保存，

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质的分子大小和分子所带电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶有以下优点

，①聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和N，N—亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶的格子是带有酰胺侧链的碳—碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电泳作用较小，不易和样品相互作用

②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度的交联结构，其孔隙度可在一个较广大的范围内变化。可以根据要分离的物质的分子大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙，又有比较好的机械性能。一般来说，含丙烯酰胺7% ~ 7.5%的凝胶机械性能适用于分离相对分子质量范围在1万至100万的蛋白质，1万以下蛋白质则采用含丙烯酰胺15% ~30%的凝胶，而相对分子质量特别大的蛋白质可采用含

丙烯酰胺4%的凝胶。由于当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双丙烯酰胺的用量，以改进凝胶的机械性能

③在一定范围内，聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定

④丙烯酰胺是比较纯净的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺的原料是丙烯酰胺，，和N，N—亚甲基双丙烯酰。丙烯酰胺是单体，N，N—亚甲基双丙烯酰称为交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶

在聚丙烯酰胺凝胶的形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和加速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应；加速剂则可加快引发剂释放自由基的速度。

补充：

SDS：十二烷基硫酸钠，熔点204℃

~ 207 ℃，分子式C12H25SO4Na，白色或淡黄色的微黏物，工业上常用于洗涤剂和纺织工业，属阴离子表面活性剂，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于氯仿、醚。SDS导致蛋白质变性，分子中疏水长链与蛋白质分子内部的非极性基团相互作用，而带负电荷的硫酸根可以与水作用，使蛋白质分子构象发生很大变化，特别是寡聚蛋白质的亚基解离，并分别与SDS定量结合，成为易溶于水的复合物。

五、缓冲作用或缓冲溶液

纯水的PH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化，然而一滴浓盐酸加到1LCH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—NaHPO4混合溶液中，H+增加不到百分之一（1.00 ×

10-7mol/L增至1.01× 10-7mol/L）PH没有发生明显变化，这种能对抗外来明显变化的作用叫缓冲作用；具有缓冲作用的溶液叫缓冲溶液。

1、缓冲溶液的组成

缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成（能对抗外来外来强碱的称为共轭酸，能对抗外来强酸的称为共轭碱）这一对共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲系或缓冲对常见的缓冲对主要有三种类型

（1）弱酸及其对应的盐

CH3COOH—CH3COONa：H2CO3—NaHCO3；

H2C8HO4—KH4C4H4O4（邻二苯甲酸—邻二甲酸纳）

（2）多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐

NaHCO3—NaCO3；NaH2PO4—Na2HPO4；KHC8H4O4—K2C8H4O4

（3）弱碱及对应的盐

NH3.H2O—NH4Cl 2、

（1）在血红蛋白的整个提取过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是让血红蛋白处在稳定的

PH范围内，维持其结构和功能

（2）凝胶电泳时加入缓冲液用于维持蛋白质所带电荷

六、透析

1、概念：穿过膜的选择性扩散过程

2、原理：透析袋能使小分子自由通过，而将大分子保留在袋内

3、目的（1）除去样品中相对分子量较小的物质

（2）用于更换样品中的缓冲液

七、血红蛋白的提取与分离

1、选材

：哺乳动物成熟红细胞

原因：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应

该收集滤液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作

2、步骤

（1）样品处理

①红细胞洗涤

②血红蛋白的释放

③分离血红蛋白溶液

（2）粗分离：透析

①凝胶色谱柱的制作

（3）纯化

凝胶色谱操作

②凝胶色谱柱装填

③样品的加入和冲洗液面

（4）纯度鉴定

→ SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

3、样品的处理

（1）选材：哺乳动物的红细胞

成熟红细胞无细胞核和细胞器，结构简单，杂质少，利于实验成功

①采集血样

→

②低速短时间离心

→

③吸取血浆

→

④生理盐水洗涤

→

⑤低速短时间离心

→

⑥重复④⑤步骤三次

→

⑦上清液中无黄色表明红细胞已洗涤干净

（2）注意事项

①为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，比例是每100ml血液中加入3.0g柠檬酸钠

②洗涤红细胞的目的是除去血浆中的蛋白质，有利于血红蛋白的分离纯化

（2）血红蛋白的释放

①目的：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白

②将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积

→

再加4%体积的甲苯（目的：溶解细胞膜）

→

置于磁心搅拌器上充分搅拌10min （3）分离血红蛋白溶液

①过程：将搅拌好的混合液转移到离心管中以2000r/min的速度离心10min ②目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分开来，便于下一步对血红蛋白的纯化

③结果

第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）

液体分为4层

第2层（中上层）脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）

第3层（中下层）血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）

第4层（最下层）杂质沉淀层（暗红色）

④注意事项：将试管中液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层于分液漏斗中静置片刻后，分出

下层的红色透明液体

⑤特别提醒：对于血液样品处理后样品发生的变化

a正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的

血红蛋白呈鲜红色

b分层不明显：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白

c红细胞不纯净的原因：是因离心速度过高或时间过长，使血细胞和淋巴细胞一同沉淀造成

4、粗分离

（1）原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内

（2）过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的浓度为20mmol/L磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析12h （3）目的：①除去样品中相对分子量较小的物质

②用于更换样品中的缓冲液

5、纯化—凝胶色谱操作

调整缓冲液面

打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面

平齐，关闭出口

加入蛋白质样品

用习惯将透析后的1ml样品沿管壁环绕移动加到色谱柱顶端，加样

后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，

关闭出口

调节缓冲液面

加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度

洗

脱

连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱

收集分装蛋白质

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液

标准：若血红蛋白的红色区域带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离

操作正确

6、纯度鉴定

对于蛋白质纯度的鉴定，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳