课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教学实录

课题：多聚酶链式反应扩增DNA片段（一）

江苏苏州吴江区平望中学

俞红成

教学目标：

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

（二）过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件[来源:学+科+网Z+X+X+K]

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作

教学难点：PCR的原理

教学过程：

（一）引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

（二）进行新课

1．基础知识

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．1细胞内DNA复制条件分析：

条件[来源:学*科*网Z*X*X*K]

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

- 1 - 模板

原料

酶

DNA聚合酶

能量

ATP

引物

RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

1．2细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：（结合投影图）

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：[来源:学科网ZXXK]

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。

1．3 DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）1．4PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在95℃时DNA解旋

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复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

（三）课堂总结、点评

（四）实例探究

例1 在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开

A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃

解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。

答案：B 例2 关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）

A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链

B.DNA复制不需要引物

C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D.DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸[来源:学。科。网Z。X。X。K]多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数

解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。

答案：C

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