课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数名师课堂实录

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”

1 教材分析与课时安排

“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”是人教版高中生物（选修1）专题2“微生物的培养与应用”的第二个课题，学生已学习了有关培养基和无菌技术的基本知识，在掌握使用平板划线法和稀释涂布法、分离和纯化微生物的实验操作的基础上，研究培养基对微生物的选择作用，并测定其数量。其中既有关于特定菌株的选择策略等知识性内容，又有土壤溶液的稀释、菌落数量统计等操作性内容，难度较大、探究性较强，是培养学生设计实验、动手操作等科学探究能力，提高生物科学素养的好素材。

本课题教学实施中的关键在于两点：①

教师要处理好知识性内容与操作性内容的关系，要让学生理解特定菌株的选择策略，并学习有关的实验方法和操作程序;②

处理好课常与课后的关系。本课题的实验操作时间不长，但是操作前要制备培养基、对培养基和其他操作用具进行灭菌，操作后的培养时间和对微生物进行观察则需要较长时间，因此需要教师精心设计教学程序，统筹安排教学时间。

根据这一教材特点，本课题教学可分2个课时进行，2个课时之间应留有2 d左右的间隔，以便进行微生物的培养与观察。

2 教学目标

2.1 知识目标

简述稀释涂布平板法分离微生物和进行微生物计数的实验原理;说出选择性培养基和鉴别性培养基的用途;归纳分离纯化微生物的原理和方法。

2.2 能力目标

学会制备土壤样本稀释液，学会用稀释涂布法将菌样液接种到固体培养基平板;学会用稀释涂布平板法进行微生物数量测定的方法。

2.3 情感、态度与价值观目标

体验科学知识的形成过程，加深对科学本质的理解;体会在实验活动中合作学习的有效性，养成严谨的科学态度。

3 教学准备

3.1 土壤样品的采集以及土壤溶液的配制

为保证实验取得预期效果，应选择经常施用尿素的农田，铲去表土后采集3～8 cm深度范围内的土壤;回实验室后，去除土壤中的植物枯枝败叶及其他杂物，用托盘天平称取样品10 g，加入到盛有90 g无菌水的锥形瓶中，震荡10 min，即制得101土壤溶液;制备完成后可置于冰箱冷藏室内备用（1～2 d）。

3.2 配制培养基并进行高压蒸气灭菌

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基（配方：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加热溶解后，加水定容至1 000 mL。如条件具备可用琼脂糖代替琼脂），

分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。

配制尿素固体培养基（配方：葡萄糖10 g，尿素1 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4 2.1g，MgSO4・7H2O 0.2 g，琼脂15 g，加热溶解后定容至1 000 mL），分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。

将上述分装好的两种培养基、装有4.5 mL 蒸馏水的带棉塞试管、装有99 mL 蒸馏水的250 mL锥形瓶、包装好的培养皿进行高压蒸气灭菌。

4 教学过程

4.1 导入新课

复习上节课内容，菌种的保存有哪些方法呢？

帮助学生巩固临时保藏和永久保藏的方法，指出，自然界存在许多微生物，比如土壤中就有很多能够分解尿素的微生物，这些土壤微生物能产生并分泌脲酶，通过分解土壤中的尿素为自身和植物生长提供氮元素，由此引出课题：在特定的土壤中可以分解尿素的微生物的数量是多少？如何从土壤中的众多微生物中分离出能分解尿素的微生物？

4.2 介绍实验原理

教师介绍Taq细菌的发现和选择过程，引导学生认识到研究微生物的分离和培养，是研究微生物利用的基础，而要选择出符合需要的特定微生物，则要从微生物的生理和代谢特点出发，创造有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

在此基础上，教师引导学生提出实验的初步设想，以尿素为惟一氮源，配制培养基，阻止不能利用尿素的微生物的生长，从而筛选出分解尿素的微生物。

4.3 引导学生实验流程

让学生设计培养基，并分析：

1、培养基中各种成分有和作用

2、从物理性质看此培养基属于哪类？

3、怎样证明此培养基具有选择性呢？

4.4 分析统计菌落数目的方法

1、介绍显微技术法用到的重要工具，血球计数板的使用

（1）利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。由于此法计得的是活菌和死菌的总和，又称总菌计数法。

（2）计算方法展示

每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?

1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）

（3）总结该方法缺点

不能区分死菌与活菌

2、介绍稀释涂布平板法

（1）

介绍原理

（2）主要事项强调

思考1：为什么测平板上的菌落数可以推测样品中的活菌的数目？

（当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。）

思考2：例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，

该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

（甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）

乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。）

思考3：

如何计算每克样品中的菌株数？

每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；

V:所用稀释液的体积；

M:稀释倍数。

（3）总结

总结：

1 为了保证结果准确，一般选30∼300 个菌落的平板进行统计

2 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

3 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

4 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；

V:所用稀释液的体积；

M:稀释倍数。

4.4观看实验操作视频，总结实验注意事项

（1）无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。后面称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在火焰旁操作。

（2）做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。例如，在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

（3） 在进行系列稀释的时候，为避免试管相互混淆，可以将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放置在试管架的另一行。这样，试管的位置就能清楚地表示出稀释进行到哪一步。

（4）细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

4.5课外延伸

1、在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

2、测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。