课题3　血红蛋白的提取和分离教学目标

新塘中学学生课堂导学提纲（生物）

课题3 血红蛋白的提取和分离

班级 姓名 学号 小组

【学习目标】

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

【重点、难点】

1、凝胶色谱法的原理和方法

2、样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

一、了解感知

(一) 凝胶色谱法 1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。

2、原理

（1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的的 。

（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。

(二) 缓冲溶液

1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。

2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

(三) 电泳 1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。

2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。

3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。

4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。

(四) 实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定

1、样品处理及粗分离

（1）目的、方法

①目的：去除（ ）

②方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），重复洗涤（ ）次，直至上清液中已没有（ ），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

（2）血红蛋白的释放

加（ ）到（ ）体积，再加40％体积的（ ）（溶解细胞膜）

，置于（ ）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. （3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 第1层（最上层）：（ ）甲苯层

高二生物

第

1 页

新塘中学学生课堂导学提纲（生物）

第2层（中上层）：（ ）的沉淀层，（ ）色薄层固体

第3层（中下层）：（ ）的水溶液层，（ ）的液体

第4层（最下层）：其它杂质（ ）的沉淀层

（4）透析

方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。

目的：将 的杂质除去。

原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

2、纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

（1）凝胶色谱柱的制作：准备材料——加工橡皮塞——安装玻璃管

（2）凝胶色谱柱的装填

（3）样品的 3、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是—— （五）操作提示

1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。

2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在

中膨胀，可以将加入其中的 用 加热，加速膨胀。

3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。

4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。

二、深入学习： 1、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么? 2、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?

3、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?

三、迁移应用

（一）选择题

1、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是( ) A、层析柱高 B、层析柱的直径 C、缓冲溶液 D、样品的分布 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是( ) A、蛋白质分子所带的电荷 B、蛋白质分子的形状

C、蛋白质分子的相对分子质量 D、缓冲溶液的pH 3、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是（ ）

A、要在采血容器中预先加人抗凝血剂柠檬酸钠 B、取血回来后，马上进行高速长时问离心

C、将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D、重复洗涤直到上清液呈红色为止

4、蛋白质的提取和分离分为哪几步( ) A、样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

5、洗涤红细胞时，离心所采用的方法是（ ）

高二生物

第

2 页

新塘中学学生课堂导学提纲（生物）

A、低速长时间离心 B、低速短时间离心 C、高速长时间离心 D、高速短时间离心

6、(2008·山东高考)科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。

(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的 不同而实现分离。 (2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。 (3)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的 ，确定该蛋白质的抗菌效果。

(4)细菌培养常用的接种方法有 和 。实验结束后，对使用过的培养基应进行 处理。

课题3 血红蛋白的提取和分离

【答案】

一、了解感知

（一）1、配色谱法 相对分子质量的大小 2、（1）多糖类化合物 通道 （2）相对分子质量 较小 较长 较慢 较大 凝胶外部 较短 较快 分子质量

（二）1、外界 酸和碱 基本不变 2、1-2 水 使用比例 （三）1、带电粒子 迁移

2、PH 多肽 核酸 正电 负点 电场

3、带电性质 大小 形状 移动速度 各种分子

4、琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（四）1、（1）去除杂蛋白 低速短时间离心 三次 呈现黄色

（2）蒸馏水 原血液 甲苯 磁力搅拌器

（3）无色透明 脂溶性物质 白色 血红蛋白 红色透明 暗红色

（4）透析袋中 透析袋 磷酸缓冲液 12h 相对分质量较小

2、加入和洗脱

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（五）1、洗涤次数 离心速度 离心时间 洗涤次数 离心速度 时间 白细胞

2、洗脱液 洗脱液的湿凝胶 沸水

3、洗脱次序 分离效果

4、均匀一致

二、深入学习

1、哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

2、蒸馏水使红细胞破裂释放出血红蛋白。

3、加入蒸馏水的目的将红细胞中的血红蛋白释放出来；加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

三、迁移应用

1－5：A C A C B

6、(1)电荷(带电情况) 迁移速度

(2)碳源 氮源

(3)数量

(4)平板划线法 稀释涂布平板法(稀释混合平板法) 灭菌

高二生物

第

3 页