课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计(第一课时)

课题3 血红蛋白的提取和分离 学习目标：了解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理

尝试对血液中的血红蛋白的提取和分离

体验从复杂体系中提取大分子的基本过程和方法

学习重点：凝胶色谱法的原理和方法

学习难点：样品的预处理

色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

自主学习：

一．基础知识——蛋白质提取和分离的原理

（一）分离生物大分子的基本思路

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

（二）蛋白质分离和提取的原理

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

（三）蛋白质分离和提取的方法

1.凝胶色谱法（又叫分配色谱法）

凝胶：一些微小的多孔球体，由多糖类化合物构成，如葡聚糖、琼脂糖，内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子筛。

概念：根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。

原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；

小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。（如图5—13 a）

过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子（如图5—13 b）

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

缓冲溶液——洗脱剂

①组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。

如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等

②配制：调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

③作用：在一定的范围内，抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，维持 pH基本不变

本课题所选用的缓冲溶液是磷酸缓冲液，其目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)

2.电泳法

概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离

类型：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳

测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙稀酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。

原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。

SDS作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

二．实验操作

选材：哺乳动物的红细胞

红细胞的洗涤

目的：去除杂蛋白，以利于血红蛋白的分离和纯化

过程：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞

＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→

吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

血红蛋白的释放

方法：吸水涨破

操作：洗好的红细胞→加蒸馏水到原有血液体积→加40%体积

样品处理

的甲苯→搅拌器充分搅拌10min→红细胞破裂，释放

血红蛋白

分离血红蛋白溶液

方法：离心分离

操作：红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）

→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

目的：除无机盐离子和小分子有机物质

透析原理：半透膜的选择透过性。大分子物质不能通过半透膜，离子和小

（粗分离）

分子能够通过半透膜。

操作：1ml血红蛋白溶液→装入透析袋→放入300ml20mmol/L PH=7的磷酸缓冲液中→透析12h

制作凝胶色谱柱：如图5—19 操作提示：

材料：交联葡聚糖凝胶G-75；

凝胶色谱柱的装填：

20mmol/L磷酸缓冲液

步骤：

步骤

操作要求

纯化——

①

固定色谱柱

色谱柱垂直固定在支架上

凝胶色谱操作

②

计算称量凝胶

根据色谱柱体积计算凝胶用量

③

配制悬浮液

①凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

②凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

④

装填悬浮液

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

⑤

洗涤平衡

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h

加样前：打开柱下端流出口，使缓冲液缓慢下降到与凝胶

面平齐，关闭出口

样品的加入和洗脱

加样：吸管吸取1ml透析后的样品加到色柱顶端，注意不

要破坏凝胶面。加样时，使吸管管口沿管壁环绕移

动，即贴着管壁加样

加样后：打开下端开口，样品完全渗入凝胶床后，关闭出

口，加磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱

瓶，打开开口进行洗脱。待红色蛋白质接近色谱

柱底端时，试管连续收集，每5ml一管。

纯度鉴定：方法：SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳

思考题：

1.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

2.血液的组成是什么？

3.血细胞中哪种细胞的数量最多？细胞中含量最多的化合物是什么？该化合物有什么样的结构

和功能？

4.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？有什么作用？

5.为了加速释放过程，采取了什么措施？

6.为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

（1）红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。（4）色谱柱成功标志：

红色区带均匀一致地移动。