课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第二课时教学实录

专题2 微生物的培养与应用

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标

1.知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。

2.过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性。

3.情感、态度与价值

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯。

二、教学重点与难点

重点：对土样的选取和选择培养基的配制

难点：对分解尿素的细菌的计数

三、教学方法

讲授法、讨论法

四、教学过程

（一）引入新课

上节课我们学习了消毒灭菌的方法、培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）进入新课

课题背景

尿素[CO(NH2)2]是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2

，而细菌能合成脲酶。

脲酶

CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3

1.研究思路

（1）筛选菌株：寻找耐高温的DNA聚合酶

耐高温的酶→耐高温生物体→耐高温环境（热泉、火山口等）

科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。实验室中微生物的筛选，也运用同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

思考：

本课题使用的培养基配方

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

①该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？琼脂的作用是什么？

碳源：葡萄糖、尿素；氮源：尿素；琼脂的作用是凝固剂。

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②从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？

物理性质：固体培养基；功能：选择培养基。

③该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有是如何进行选择的？

具有选择作用，其选择机制是只有能够以尿素为氮源的微生物才能在该培养基上生长。

（2）选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

（3）如何对细菌进行计数？

a.显微镜直接计数法：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。（测定微生物数量的常用方法）

公式：细胞数/mL=（100小格内细胞个数/100）*400*10000*稀释倍数 （16*25血球计数板）

优点：能准确统计微生物的实际数目。

缺点：不能区分死菌和活菌。

b.稀释涂布平板法（活菌计数法）

原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。

公式：每克样品中的菌株数=（某一稀释度下平板上生长的平均菌落数/涂布的稀释液的体积）*稀释倍数

注意事项：

*为了保证结果准确，一般设置三个或三个以上的平板，选择菌落数在30-300的平板进行计数，并取平均值；

*统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。

思考：阅读课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板）

第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值

（4）设置对照

主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

思考：阅读P22～23页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。

(1)A同学出现此结果的可能原因？

土样不同；培养基污染 (或混入了其他的含氮物质)。

(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？

方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

2.实验设计

（1）实验设计的内容实验方案、所需仪器、材料用具药品、实验步骤及时间安排等。

（2）根据图2-7及提供的三个资料填写实验流程：

土壤取样→制备培养基→样品稀释涂布平板→微生物的培养与观察→菌落计数

*土壤取样

取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。与其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。大约70%—90%是细菌。

土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。

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取样部位：距地表约3-8cm的土壤层。

*制备培养基

a.选择培养基（尿素为唯一氮源）

b.牛肉膏蛋白胨培养基

思考：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？

相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

*样品稀释涂布平板

分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。

456345234细菌稀释度为10、10、10；放线菌稀释度为10、10、10；真菌稀释度为10、10、10。

*微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。

细菌：30～37℃培养1～2d；放线菌：25～28℃培养5～7d；霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

菌落的特征包括形状、大小、隆起程度和颜色等方面。

*菌落计数

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 （3）实验过程

a.取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

b.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

d.实验中要对培养皿做好标记，注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

e.为提高工作效率，操作时做到有条不紊，需要事先制定计划。

注意：研究未知微生物时，一定要注意进行规范的无菌操作，以防被致病的微生物感染。实验后，一定要洗手。

3.结果分析与评价

（1）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？

对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。

牛肉膏培养基的菌落数目多于选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

（2）对分离的菌种做进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，可以通过检测培养基pH变化来判断化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

（三）课堂小结

筛选微生物的原理：（人为条件）有利于目的菌株生长

抑制或阻止其他微生物生长

土壤中分解尿素的 微生物计数方法与原理：显微镜直接计数法、稀释涂布平板法

细菌的分离与计数 对照实验设置

实验设计→实验方案→实验操作→结果与分析

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（四）课堂练习

1.下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是（ ）

A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素

B.筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质

C.统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法

D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌

62.某同学在稀释倍数为10

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） （ ）

8 9A. 2.34×10 B. 2.34×10

C. 234 D. 23.4 3.下列说法不正确的是（ ）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多

4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）

A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质

C.青霉素类药物 D.高浓度食盐

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