课题3　血红蛋白的提取和分离公开课教案

向下移动。

（4） 不同的蛋白质分子完全分开；

（5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。

㈡ 缓冲溶液：

1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：能够抵制

的对溶液的 的影响，维持PH基本不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由

种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制

得

使用的缓冲液。

思考：说出人体血液中缓冲对？

思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）

㈢电泳：

1、概念：指 发生迁移的过程。

2、原理：许多重要的生物大分子，如 等都具有 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。

3、分类：

带电性质、分子大小和形① 加入待分离状的不同，使分子迁移速的样品

电泳

② 阴阳极

电泳。

极

测定（

蛋白质相对分子质量

）溶

液通常用十二烷基硫酸钠（SDS）槽

琼—聚丙稀酰胺凝胶电泳

脂胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的分子向阳极移动

缓冲液

迁移率取决于它所带静电荷的凝胶电泳原理示意图

多少以及分子的大小等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。

二

实验操作

2

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定

1.样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除 ②方法： 离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入 再加入用 的 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤

⑤低速离心（低速短时间）

⑥重复4、5步骤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

(2)血红蛋白的释放

加 到 体积，再加40％体积的 溶解细胞膜）

，置于 上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 第1层（最上层）： 甲苯层

第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体

第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体

第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层

(4)透析

2.凝胶色谱制作

1）凝胶色谱柱的制作

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c.剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做 ，连接一细的 ，并用螺旋夹控制尼龙管的 ，另一端放入收集 的收集器内

③顶塞的制作：

插入安装了玻璃管的橡皮塞

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

2）凝胶色谱柱填料的处理

（1）凝胶的选择： 。

3

（2）方法：

配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。

（3）凝胶色谱柱的装填方法

①

固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分 12小时。

3）样品加入与洗脱

（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口

（2）加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

②滴加透析样品：用 将1ml 的样品加到色谱柱的 ③样品渗入凝胶床： ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱

⑤收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管连续收集

思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。

3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

电泳方法步骤

1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备

3）样品处理： 4）把凝胶固定于电泳装置上

5)加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品

6)电泳

7）剥胶 8）染色 9)脱色 10)观察结果 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。

三

实验结果分析与评价

4

观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

讨论：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。

【典例解析】

例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）

A.相对分子质量大的

B.溶解度高的

C.相对分子量小的

D.所代电荷多的

例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）

A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）

A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快

【达标反馈】

1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度

2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。

A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度

3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。

A相同 B相反 C相对 D相向

4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。

A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白

5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。

A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞

6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。

A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠

7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ）

A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物

答案：BBBACDC

5

二、非选择题

1．电泳利用了待分离样品中各种分子 以及 、 的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

答案：带电性质的差异；分子本身的大小；形状的不同

2．你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

【反思总结】

【典例解析】答案：

例1解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A 例2解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术答案：C 例3解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。答案：D 【达标反馈】参考答案：

解释：

1、凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，所以选B。

2、缓冲液在生物学实验中起着举足轻重的作用，它维持溶液pH相对稳定，能“中和”外加酸或碱的化学成分，所以选B。

3、电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷相反的电极移动，所以选B。

4、血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。所以选A。

5、血液里除了各种细胞，剩下的液体都是血浆，血细胞中又数红细胞最多，单个的体积也最大，所以选C。

6、柠檬酸钠,能起到防止血液凝固的作用，所以选D。

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7、将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层：第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体,这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。所以选C。

2答案：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；在经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

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