课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计模板

选修一

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的教学设计

课题名称

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【学习目标】：研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定

【研究对象】：土壤中能分解尿素的细菌

【达到目标】：

（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

【情感、态度与价值观】：养成良好的勤洗手，讲卫生的好习惯

课题导入：

尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发现的

设置问题一：如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌？

1.培养基的类型：固体？液体？选择？鉴别？天然？合成？

实验室中微生物的筛选应用的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

选择性培养基--在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

配制选择培养基的依据：

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

2.培养基选择分解尿素的微生物的原理是什么？

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以就能够选择出分解尿素的微生物。

3.培养基的组成成分

学生分析：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？

设置问题二：需要遵循的实验原则？

1.设置对照的主要目的

实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因

学生讨论，师生总结原因写法

原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)

补充实验方案

方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验

结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

提出问题：学生思考，讨论

如何设置对照证明培养基配置是否合格？

如何设置对照证明选择培养基的确具有选择作用？

设置问题三：如何统计细菌数量

1、显微镜直接计数：菌体本身

利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量

优点：计数方便，操作简单

不足：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察；

2、活菌计数法

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。

介绍稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数

2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC（在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义。

3.本法仅限于形成菌落的微生物

计算方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

【算一算】

某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（

）

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4（答案B）

设置对照的意义：

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果

【注意事项】

①

为保证结果准确，一般选择菌落数在30--300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

④涂布平板法所选择的稀释度很重要

师生一起学习实验的具体操作

㈠.土壤取样：

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

㈡.制备培养基：

制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。

[三]样品的稀释

样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106

测定放线菌的数量，一般选用103 104 105

测定真菌的数量，一般选用102

103 104

◆应在火焰旁称取土壤10g。

◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行

◆分离不同的微生物采用不同的稀释度

原因：不同微生物在土壤中含量不同

目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板

问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

学生讨论回答：

原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。

结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

㈣.取样涂布

◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等

◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

㈤.微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

展示图片，获得感性认识

三、结果分析与评价

1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

四、操作提示：无菌操作、做好标记，规划时间

五、课外延伸

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。

【课堂练习】

下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是(

) A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素

B.筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质

C.统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法

D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，

若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌

【方法点拨】

1.筛选分解尿素的细菌的实验中，采用以尿素为唯一“氮源”的培养基

2.统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法

3.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

【板书设计】