课题3　血红蛋白的提取和分离教学评价实录

巩留县高级中学教案

年级：高二

学科：生物

主备人：吴春霞 二次备课

专题一 DNA和蛋白质技术

课题3 血红蛋白的提取与分离

第一课时

授课时间: 备课时间：2018年3月20日

课时：2.5课时

课型：新授课

【教学目标】

知识与技能：1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

过程与方法：

通过对血红蛋白提取与分离实验进行分析与评价，培养学生实验分析能力和严谨的思维能力。

情感态度价值观：初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。

【教学重点】凝胶色谱法的原理和方法。

【教学难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【课时安排】2.5课时

【教学过程】

第一课时

引入新课：

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

一、基础知识

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：（见课件图）

分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

[来源:Z。xx。k.Com]

[来源:Zxxk.Com]

（3）分离过程：

1

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

2、缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4 等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3、凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

决定运动

方向

√

形成库仑力

√

形成阻力

√

√

决定运动速率

Z+X+X+K][来源:学+科+网

√

√

√

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多 的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

布置作业：练习册

教学后记：

2

第二课时

授课时间: 备课时间：2018年3月20日

二、实验设计

1、蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2、选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读投影资料，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由 和 两部分组成。

血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。

该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。

3、从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为：

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸

3

过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

4、如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

5、凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：

色谱柱的装填过程。

步骤

①

操作要求

②

计算称量凝胶

③

配制悬浮液

④

装填悬浮液

⑤

缓冲液洗涤平衡

操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

三、课堂总结、点评

4

【布置作业】完成课时检测

【板书设计】 课题3：血红蛋白的提取和分离

一、基础知识

1、凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。

2、缓冲溶液

3、电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

二、实验操作

1、样品处理及粗提取

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

2、凝胶色谱操作

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

教后小记：

6