复习与测试第二课时教学实录

选修一 专题2 微生物的培养与应用

专题2 微生物的培养与应用 课题1 微生物的实验室培养

一、培养基

1.概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。

2.种类：

依据物理性质分为 培养基和 培养基等。

．． 在液体培养基中加入凝固剂 后，制成 培养基，它是试验室中最常用的培养基之一。琼脂是一中从 中提取的 ，98℃以上熔化， 以下凝固，在常规培养条件下呈现 态。微生物在 培养基表面生长，可以形成肉眼可见的 。

培养基的类型及其应用：

目的用途

培养基

添加（或缺少）某种化学成分

菌种的分离

化学组成

天然培养基

培养基

由天然成分配制而成，培养基成分不明确

添加某种指示剂或化学药剂

工业生，产降低成本

菌种的鉴别

物理性质

标

准

培养基类型

培养基

半固体培养基

培养基

合成培养基

配

制

特

点

加入琼脂较多

加入琼脂较少

不加入琼脂

由已知成分配制而成，培养基成分明确

主

要

应

用

菌种分离,鉴定,计数

菌种保存

工业生产，连续培养

菌种分类、鉴定

3.营养结构：

各种培养基的化学成分一般都含有 、 、 、 四类营养成分，此外．．还要满足微生物生长对 、 物质以及 的要求。

例如，培养乳酸杆菌时需要添加 ，培养霉菌时需要将培养基pH调节为 性，培养细菌时需要将pH调节为 性或 性，培养厌氧微生物时需提供 的条件。

例如，含有C、H、O、N的化合物既可以作为 源，又可以作为 源，如氨基酸等。牛肉膏和蛋白胨来源于 （动、植）物原料，主要为微生物提供糖、维生素和有机氮等营养物质，是培养基的 源、 源和维生素。未必所有培养基都必须添加碳源或氮源，如自养微生物的培养基不需添加 源，自生固氮菌的培养基不需添加 源。

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该培养基含有显色剂(伊红美蓝)，可使大肠杆菌菌落呈现金属光泽，因此属于鉴别培养基。

(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入某些物质。依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。

(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的。培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物。如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

(4)通过某些特殊环境分离微生物。如在高盐环境中可分离耐盐菌；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物。

(1)在涂布接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格，不能留有杂菌。(2)用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后的划线时，从上一次划线末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)稀释涂布平板法接种培养后得到的结果应为图B。振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高____________的利用率。

(4)振荡可以使细菌分散，更有利于细菌利用培养液中的营养物质，并且可以使培养液中的溶解氧增多。

(1)实验室常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)，在实验前应用牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。(2)酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑制细菌、放线菌的生长。(3)图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。(4)接种的平板上未见菌落生长，说明接种不成功，原因可能是接种环灼烧后未冷却，使菌株因温度过高而被杀死。

1．(2014·江苏高考节选)为了获得β­胡萝卜素产品，某小组开展了产β­胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。请回答下列问题：

(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是________________________________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该______________________。

(2)为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是______________。

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(3)右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙__________。

(填序号) ①安全阀、放气阀、压力表

②放气阀、安全阀、压力表

③安全阀、放气阀、温度表

④放气阀、安全阀、温度表

指示的依次是(4)为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是________________________________________。

解析：(1)实验室常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)，在实验前应用牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。(2)酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑制细菌、放线菌的生长。(3)图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。(4)接种的平板上未见菌落生长，说明接种不成功，原因可能是接种环灼烧后未冷却，使菌株因温度过高而被杀死。

答案：(1)干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)

用牛皮纸(报纸)包扎器皿

(2)抑制细菌(放线菌)的生长

(3)①

(4)接种环温度过高，菌种被杀死

二、无菌技术

1．获得纯净培养物的关键是：防止 的入侵，具体操作如下：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和 ；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 ；

（3）为避免周围环境微生物污染，实验操作应在 附近旁进行；

（4）避免已灭菌处理的材料用具与 相接触。

2.比较消毒和灭菌概念

消毒是指使用

的物理或化学方法杀死物体表面或内部的

微生物，不包括

和

。

灭菌则是指用

的理化因素杀死物体内外

的微生物，包括

和

。

无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是 。

备注：

芽孢：某些细菌（芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球菌等）在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，

厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造，称为芽孢。恶劣环境下，一个细菌产生一个芽孢，条件适宜时重新成为一个细菌，数量没有增加，因此芽孢不是细菌的繁殖体，是休眠体。

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孢子：脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。它是有丝分裂或减数分裂的产物。

3.消毒方法：

（1）日常生活经常用到的是 消毒法；

（2）对一些不耐高温的液体，则使用 消毒法，如 ；[

（3）人们还用 进行消毒，如实验操作者的双手使用 进行消毒，饮水水源用

进行消毒。

（4）实验室里还可以用

或

进行消毒，如接种室、接种箱或超净工作台，首先喷洒

或 溶液等消毒液加强消毒效果，然后使用 照射30分钟，进行物理消毒。

4.灭菌方法：

（1）接种环、接种针、试管口等使用 灭菌法；

（2）玻璃器皿、金属用具等使用 灭菌法，所用器械是 ；

（3）培养基、无菌水等使用 灭菌法，所用器械是 。

（4）表面灭菌和空气灭菌等使用 灭菌法，所用器械是 。

三、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

→ → →（调PH）→ → 1. ：根据培养基

比例，计算100mL培养基各成分用量。

2. ：牛肉膏比较 ，可用 秤取。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要 ，

目的是防止牛肉膏吸收空气中 。

3. ：①牛肉膏+称量纸+水，加热熔化后取出称量纸；

②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；

③加入 ；

④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒 ，目的是防止琼脂 而

导致烧杯 。

4. ：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏 性。

5. ：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用 灭菌；所用培养皿

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用报纸包扎后用 灭菌。

6. ：待培养基冷却至 左右时在 附近操作进行。

①锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的 ，防止 感染 。

②平板倒置的目的是防止培养基冷却过程中形成的 落到培养基表面造成污染。若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板 （能、否）培养微生物，否则空气中 会在这些粘附培养基上繁殖，并污染 。

③配制斜面培养基时，试管要加塞棉塞的目的是保持 并防止 。

④试管培养基形成斜面的作用是增大 面积。

四、纯化大肠杆菌（微生物的接种）

1.方法：微生物接种的最常用方法是 和 ，另外还有 和

等。其核心是防止 的污染，保证培养物的 。

纯化微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线法可以分离微生物但不能对微生物进行计数，稀释涂布平板法既可分离微生物也可以对微生物进行计数。

（1） 法：通过接种环在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步

到培养基表面。其操作步骤是：

平板划线操作的五大注意事项

第一次操作

每次划线之前

杀死上次划线后接种环上残留的目的

杀死接种环上原有的微生物

菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少

划线结束

杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者

(2)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

(3)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

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(4)划线时最后一区不要与第一区相连。

(5)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。

[自主排查]

1．请据某微生物培养基的配方表回答下列问题

编号

成分

含量

①

(NH4)2SO4

0.4 g ②

KH2PO4

4.0 g ③

FeSO4

0.5 g ④

CaCl2

0.5 g ⑤

H2O 100 mL (1)此培养基按物理性质划分属于液体培养基，因为没有凝固剂(如琼脂)；按功能划分属于选择培养基，因为没有碳源，只有自养型微生物才能生长(利用空气中的CO2)。

(2)此培养基含有的微生物的营养成分包括水、无机盐和氮源三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括碳源、氮源和生长因子。

(3)若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂(琼脂)。

(4)若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中①成分(填表中序号)，应加入尿素和不含氮元素的有机物。

2．下图是倒平板的操作，请填空

(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。

(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。

(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。

3．下面是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请完成

(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是稀释涂布平板法、平板划线法。

(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？

提示：最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。

①取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的 ；

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除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上 ；

取菌种和划线前都要求接种环 后进行，其目的是防止 ；

最后灼烧接种环的目的是防止 污染 和 。

②在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由 形成的 。

（2） 法：将 进行一系列 ，并将不同 菌液分别涂布到琼脂 固体培养表面进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的 。

注意：操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。移液管需要经过灭菌，整个操作过程中使用1支移液管。

2.鉴定：将接种后的培养基和一个 的培养基都放入 恒温箱中，培养12h和24h后分别记录观察。

3.结果分析：

（1）培养未接种培养基的作用是 ，若有菌落形成，说明培养基 不彻底。

（2）培养12h和24h后的菌落大小 （相同、不同）；菌落分布位置 （相同、不同）。

原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越 ，菌落体积越 ；菌落的位置不动，但菌落数增多。

4.菌种保存：

（1）频繁使用的菌种利用 法保存。利用 培养基培养后，保存在 ℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较 ，容易发生 和 ；

（2）长期保存菌种的方法是 法。将菌种与无菌甘油等量等体积混合后保存在 ℃冷冻箱中。

(1)在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。(2)在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆积在培养基表面影响分离效果。(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。(4)因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。(5)考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下观察在不同温度和pH条件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤第7页

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胃发酵。

用显微镜直接对微生物进行计数，需要用血细胞计数板。如果对活菌进行计数，则要用稀释涂布平板法涂布平板，培养后统计菌落数目，然后计算出活菌数量。

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离

一、选择培养基

1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括 、 等)，同时 或 其他微生物生长。

例：①PCR（ 反应）是一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术的自动化，要求使用耐 的DNA聚合酶。科学家从黄石公园的热泉中分离出 ，该细菌含有耐高温的 酶。

②尿素是一种重要的农业 肥，但不能直接被微生物吸收。只有被土壤中的 将尿素分解成 之后，才能被植物吸收利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成

酶。科学家从只含 作为 的培养基分离出该细菌。

2.选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

3.根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。

例：

培养基中不加含碳有机物的无碳培养基，可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素的无氮培养基，可以选择培养 菌；加入 ，可选择培养金黄色葡萄球菌等。加入 的培养基，可以选择培养酵母菌、霉菌等真菌。

4.土壤中分解尿素的细菌的分离：以 为唯一氮源的选择性培养基进行选择。

5.土壤中分解尿素的细菌的计数： 。 通过统计平板上的 数，就能推测样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择 数在 的平板进行计数。观察记录的菌落特征包括形状、 、 、

颜色等方面。统计的菌落数往往比活菌的实际实际数目 （高、低）。这是因为当 或 个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 个菌落。因此，统计结果一般用 数而不是用第8页

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活菌数来表示。除了上述活菌计数法外， 直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

二、土壤中分解尿素的细菌的分离实验设计

配制土壤溶液→ → → 。

将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

三、脲酶的检测

对土壤中分解尿素的微生物还要借助生物化学方法做进一步鉴定。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成 ，使培养基的 性增强，PH值 。因此我们在以尿素为唯一 源的培养基中加入 指示剂，培养后，指示剂将变 。

课题3 分解纤维素的微生物的分离

一、课题背景

纤维素是一种由 首尾相连而成的高分子化合物，植物每年产生的纤维素能被土壤中的某些微生物分解利用，是因为它们能产生 。对这些微生物的研究与利用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产 ，用 处理服装面料等。

二、理论基础：

（一）纤维素和纤维素酶

1．纤维素的分布： 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含。

2．纤维素酶的作用：纤维素酶是一种 酶，一般认为它至少包括三种组分，即 酶、

酶 酶，前两种酶使纤维素分解成 ，第三种酶将纤维二糖分解成 。

（二）纤维素分解菌的筛选

1.纤维素分解菌的筛选方法---- ，这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

2.纤维素分解菌的筛选方法的原理

刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成 ，但并不和 、 发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的 。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

三、实验操作

（一）分离分解纤维素的微生物实验流程：

土壤取样→ →梯度稀释→ → 。

（二）刚果红染色法

方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。

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方法二：在 时就加入刚果红。

四、结果分析与评价

1.为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有

发酵和 发酵。

2.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 含量进行定量测定。

五、课题延伸

本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行 的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的 进行定量的测定。

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