课题3　分解纤维素的微生物的分离优质课教案设计

选修1 分解纤维素的微生物的分离

一、纤维素和纤维素酶：

1、纤维素：

（1）化学组成：

C、H、O三种元素

→

葡萄糖（单体）

→

纤维素（高分子化合物）

（2）基本单位：葡萄糖。（纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物。）

（3）含量：是地球上含量最丰富的多糖类物质。

（4）分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

（5）纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

2、纤维素酶：

（1）组成：

纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

（2）作用：

纤维素在C1、CX酶的作用下，分解为纤维二糖，纤维二糖在葡萄糖苷酶的作用下，被分解为葡萄糖。

土壤中的细菌分解尿素，是因为它们能合成脲酶。

（3）实验证明：

纤维素酶可以水解滤纸条：

注意：其中B试管起了对照的作用。

本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操作方法是：在一支试管中加入适量（1mL）的纤维素酶，在另一支试管中不添加纤维素酶，但需要加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的PH。

二、纤维素分解菌的筛选：

1、原理：

纤维素分解菌产生的纤维素酶能分解刚果红和纤维素形成的红色复合物，使培养基上出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

2、方法：刚果红染色法

（1）刚果红（CongoRed，简称CR）：是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

（2）方法：

①

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

②

方法二：在倒平板时就加入刚果红

③

两种刚果红染色法的比较：

三、实验设计：

1、实验流程：

（1）土壤取样：

①

取样环境：富含纤维素的环境（树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）

②

人工设置的纤维素分解菌生存的适宜环境：一般将滤纸埋在深约10cm左右的土壤中，经过30d左右，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。

（2）选择培养：用富含纤维素的选择培养基扩大培养

①

目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

②

制备选择培养基：

A、

纤维素分解菌的选择培养基配方：

B、注意：

C、上述配方是液体培养基，原因是：没有凝固剂（琼脂）。

这个培养基具有选择作用，原因是：本配方中纤维素做为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物才能大量繁殖。

可以设计对照实验来说明选择培养基的选择作用：自变量为培养基的种类，即完全培养基和选择培养基，可以用完全培养基做对照，或将纤维素改为葡萄糖。

说明：上述配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖，但因酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。

B、操作方法：

将土样加入装有30ml 选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定的温度下振荡培养1～2d，直至培养液变混浊。吸取一定的培养液（如5ml），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。吸取适量的培养液，稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

（3）梯度稀释：依次稀释101～106倍

（4）涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

①

制备鉴别培养基

D、②

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。

（5）挑选产生透明圈的菌落

（6）纯化培养：在产生明显透明圈的菌落，挑选并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30℃～37℃培养。

2、纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基的区别

（1）纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因为培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。

（2）能产生纤维素酶的微生物能以纤维素作为碳源和能源，在培养基中正常生长，其他绝大多数生物不能正常生长。

（3）鉴别培养基中含有琼脂，为固体培养基，刚果红染色法应用的就是此培养基。

四、尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定的比较：

五、课题延伸——纤维素分解菌的鉴定：

1、为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

2、纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

六、温馨提醒，答题必备：

1、纤维素分解菌的筛选原理：

（1）纤维素的化学本质：多糖。

（2）纤维素酶是复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

（3）方法：刚果红染色法。

2、纤维素分解菌的筛选步骤：

土壤取样

→选择培养→

梯度稀释

→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

3、纤维素分解菌筛选后的鉴定：

（1）发酵产纤维素酶的实验。

（2）葡萄糖的定量测定

4、纤维素酶的作用是：纤维素在C1、CX酶的作用下，分解为纤维二糖，纤维二糖在葡萄糖苷酶的作用下，被分解为葡萄糖。

5、刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

6、分离后，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。