课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt配套的教学设计及说课稿

2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教学目的：

1.研究培养基对微生物的选择作用。

2.简述尿素在生产实践中的作用及分解尿素的细菌的作用。

3.进行土壤中分解尿素细菌的分离与计数。

4.简述活菌计数技术的应用。

教学重难点：

重点：对土样的选取和选择培养基的配制

难点: 对分解尿素的细菌的计数

课题背景：

尿素是农业氮肥，但它不能直接被植物吸收，只有在土壤细菌的作用下分解成氨才能被吸收并提供氮肥。

CO(NH2)2+H2O――→

CO2＋2NH3

研究思路：

根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就令尿素作为培养基中的唯一氮源。可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增值，在数量上占优势。 实验设计：

1实验流程

脲酶2实验设计

包括的内容有： 、 、 和 ，具体

的实验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

实验设计原则：设计重复组（3个）

设计 。

3实验步骤

（1）土壤取样：土壤有 之称，土壤中微生物 ，在

表层，有更多的微生物生长，土壤中的微生物大约 是细菌，细菌适宜生活在 取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土取距地表约 的土壤层，迅速取土壤并装入____________密封

（2）样品稀释

稀释原因：样品稀释程度直接影响 ，

稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在 ，适于计数的平板

稀释倍数：测定细菌：选用稀释 倍

，测定放线菌：选用稀释 倍 测定真菌：选用稀释 倍

（3）微生物的培养与观察

培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。[来源:Z*xx*k.Com]

细菌： 放线菌： 真菌： 观察：在实验过程中，一般每隔 统计一次 数目，选取菌落数目 的记录作为结果，这样可以 。

菌落特征： 选择培养基的配制：

培养基组成

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

水

（4）细菌的计数[来源:Z|xx|k.Com]含量

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 容到1 000 mL

提供的营养或作用

无机盐

碳源

氮源、能源

凝固剂

氢元素、氧元素

当菌落数目稳定时，选取菌落数在

的平板进行计数。在

下，至少对

个平板进行重复计数，然后求出

，并根据平板所对应的稀释度计算菌的数目。

稀释涂布平板法(或活菌计数法或间接计数法) (1)操作

①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布出样品中细

于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中含菌数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

优点：计数的是活菌

缺点：操作较复杂，有一定误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数低。

备注：用稀释涂布平板法计数微生物时注意事项

①稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。

②计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。

③间接技术法统计的菌落数往往比实际数目低，原因有：

当两个或多个细菌连在一起繁殖时，平板上观察到的只是一个菌落。

统计结果只是活细菌产生的菌落数，而不包括死细菌的数目。

④为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，要设置重复组，取其平均值。

显微镜直接计数法

(1)方法：用血细胞计数板计数。血细胞计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm和高0.1 mm的计数室，在1 mm的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。

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微生物的培养与观察：

①培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。②计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。③观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。

（4）结果分析

是否有杂菌污染：

①对照组培养基上无菌落生长⇒未被杂菌污染

②实验组培养基上菌落数偏高⇒被杂菌污染

③实验组培养基上菌落形态多样，菌落数偏高⇒培养基上可能混入其他氮源

（5）分解尿素的细菌的进一步鉴定

鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基碱性增强，PH升高。因此可以通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生。

脲酶即：CO(NH2)2+H2O――→ CO2＋2NH3

鉴定方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则PH升高，说明该种细菌能分解尿素。

课后习题：

1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（

）

A.在液体培养基上进行

B.至少接种一种细菌

C.接种一个细菌

D.及时补充消耗的营养物质

2.使用选择培养基的目的是（

）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别

3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是(

)

A.CO2和N2

B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素

D.葡萄糖和尿素

4.下列说法不正确的是（

）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该的可信度

D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。来源学&科&网Z&X&X&K]

5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（

）

A.较多的氮源物质

B.较多的碳源物质

C.青霉素类药物

答案：ACDBC

D.高浓度食盐