课题3　分解纤维素的微生物的分离优秀完整教案

分解纤维素微生物的分离

1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。

①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中的1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。

③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。

(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

2．分解纤维素的微生物的分离

(1)纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用

――→纤维素C1酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖

(2)纤维素分解菌的筛选

①原理

纤维素分解菌

↓

刚果红――――→纤维素→红色复合物纤维素酶红色消失，出现透明圈。

②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程

土壤取样：富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓

梯度稀释：制备系列稀释液

↓

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落

归纳总结

两种纯化细菌方法的辨析

比较

平板划线法

项目

关键

操作

注意

每次划线前后均需灼烧接种环

事项

菌体

获取

优点

微生物的单细胞菌落

缺点

(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(

×

) (2)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(

×

) 不能对微生物计数

微生物进行计数

操作复杂，需要涂布多个平板

在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体

可以根据菌落的特点获得某种功可以适当增加稀释度的范围

从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体

既可以获得单细胞菌落，又能对接种环在固体平板培养基表面连续划线

①一系列的梯度稀释

②涂布平板法操作

稀释度要足够高，为确保实验成稀释涂布平板法

(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(

√

) (4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(

×

) (5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(

×

)

研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示，将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图2，请分析：

(1)透明圈是如何形成的？

提示

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，形成透明圈。

(2)图中透明圈大小代表什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？

提示

透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株①。

(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？

提示

J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。

命题点一

选择培养基成分及配制方法的分析

1．(2018·全国Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：

(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。

(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。

(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是____________________________________________________________________ ____________________________________________。

(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：

甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；

乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。

有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________ _______________________________________________________________________________。

答案

(1)细菌

选择

(2)碳源、无机盐

蛋白质、核酸

(3)碘液

淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈

(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差

解析

(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30～300个的平板，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，

1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。

2．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯

酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请据图回答下列问题：

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基______________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______________________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于____________ _______________________________________________________________________________。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是______________________________________ _____________________________________________________________。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？

_______________________________________________________________________________。

答案

(1)苯酚

影响

稀释涂布平板

(2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源

防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基

(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作

解析

(1)选择只能降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用稀释涂布平板法来测定②中活菌数目。(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源；采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要进行无菌操作。无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

命题点二

微生物分离与计数的实例分析

3．(2018·山东、湖北部分重点中学高考冲刺模拟)从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，

具有下列类似的操作过程：

(1)在过程④的选择培养基是________培养基(填“固体”或“液体”)，过程⑧的选择培养基是________培养基(填“固体”或“液体”)。④的具体操作是________________；⑧的具体操作是________________________________________________________________________。

(2)在过程③样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为____________________________。

(3)过程⑩采用______________________的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是___________________________________________________ _____________________________________________________。

答案

(1)固体

液体

以尿素为唯一氮源

以纤维素为唯一碳源

(2)稀释涂布平板(或平板划线)法

(3)倒平板时加入刚果红染液

不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈

解析

(1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程④的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程⑧所示的选择培养，因此过程⑧的选择培养基是液体培养基。④选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；⑧选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以⑧的具体操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用稀释涂布平板(或平板划线)法，将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程⑩采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌的菌落。

4．(2018·重庆高三第二次诊断)北方每年在小麦丰收的季节，焚烧秸秆火焰四起，烟雾弥漫，不但导致严重的雾霾而且造成资源的浪费。科学家为了解决这个问题，努力寻找分解秸秆中纤维素的微生物，他们做了如下实验，据图回答：

→→→

→

甲

(1)根据甲图，选择培养纤维素分解菌要用__________。为了统计样品中活菌的数目，常用方法除稀释涂布平板法外，还有______________的方法。

(2)乙图是培养出的单菌落示意图，最适合分解秸秆的两个菌落是____________(填数字)，纤维素分解菌将纤维素最终分解为____________。从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能的原因是____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)为了长期保存该微生物，可以采用________的方法。

答案

(1)选择培养基

显微镜直接计数

(2)1和4

葡萄糖

土壤中纤维素分解菌较少，稀释的倍数太大

(3)甘油管藏

解析

(1)从土壤样液中筛选能分解纤维素的细菌所用的培养基是选择培养基。统计样品中活菌的数目，常用稀释涂布平板法或显微镜直接计数的方法。(2)透明圈的大小反映了细菌分解纤维素的能力大小，所以乙图中最适合分解秸秆的两个菌落是1和4；纤维素是多糖，最终被纤维素分解菌分解成葡萄糖；从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能是土壤中纤维素分解菌较少，稀释的倍数太大所致。(3)长期保留菌种可用甘油管藏的方法。

矫正易错

强记长句

1．灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

2．划线时最后一区不要与第一区相连。

3．划线时用力大小要适当，这是为了防止用力过大将培养基划破。

4．用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低

，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。

下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：

1．图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用稀释涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。

2．接种操作在火焰附近进行的原因是火焰附近为无菌区域。

3．接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。

重温高考

演练模拟

1．(2017·全国Ⅰ，37)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是___________________________ _________________________________________________________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择__________________________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有

______________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。

答案

(1)脲酶

分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物

为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

(2)尿素

其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH的稳定

解析

(1)细菌分解尿素是由于细菌体内能合成脲酶，尿素是有机物，分解尿素的细菌是分解者，属于异养型生物，因此不能利用CO2作为碳源合成有机物。葡萄糖通常既作为碳源，也作为能源。(2)筛选分解尿素的细菌，通常只能用尿素作为唯一氮源，“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”均含有无机氮源NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4可为微生物生长提供P元素和无机盐离子，如K和Na，还可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH的稳定。

2．(2016·全国Ⅰ，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是＋＋______________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

答案

(1)牛肉膏、蛋白胨

琼脂

(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间

(3)污染

不正确

解析

(1)牛肉膏和蛋白胨都含有蛋白质的水解产物，都可以作为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内不同高度空气中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。

3．(2016·四川，10节选)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

(1)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，每克土壤样品中的细菌数量为__________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较__________。

(2)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________________，突变基因表达的蛋白质含____________个氨基酸。

答案

(1)1.75

少

(2)UGA

115 解析

(1)用于统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克土壤样品中的细菌数为(156＋178＋191)÷3÷0.1×105＝1.75×108(个)。由于两个或多个细胞连接在一起时，往往统计的是一个菌落，故用此方法测得的细菌数较少。(2)密码子由三个相邻的碱基组成，271个碱基和后面2个碱基一起共构成91个密码子，箭头处插入的70个核苷酸和后面2个碱基一起共构成24个密码子，紧随其后是UGA，为终止密码，因此表达的蛋白质含115个氨基酸。