课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教学设计案例

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、教学目标

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

二、教学重难点

重点：PCR的原理和PCR的基本操作

难点：PCR的原理

三、教学对象分析

高二年级的学生经过一年半的时间学习，已经具有一定的自学能力和知识的归纳总结能力，加上在前面已经对DNA的结构、特性以及DNA的复制过程知识进行了学习，对DNA分子有了一定基础的理解，本节课的内容是建立在DNA的复制基础上的人工扩增DNA的技术，也就是现在生物分子学上应用广泛的PCR技术。现阶段的学生正处于一种求知欲旺的状态，对于一些未知领域的学习，学习的积极性更高，同时本节课的内容对后面基因工程的学习奠定了基础。

四、教学过程

（一）引入新课

河南安阳“曹操墓”自发掘以来备受争议，为此，复旦大学进行DNA检测。儿子能完整地继承父亲的Y染色体，男性有着与父系祖先相同的基因密码，只要检测足够多的曹姓男子

DNA，便可以找到曹姓家族应有的独特“密码”，然后和“曹操墓”出土人骨DNA中Y染色体对比验证。这个过程中对采集的DNA样本如何进行扩增？——引出本节课的内容——多聚酶链式反应扩增DNA片段

（二）进行新课

1．基础知识

PCR的定义：DNA体外扩增技术，实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA片段。

［思考］体内DNA复制过程需要什么条件? 1．1细胞内DNA复制条件分析：

条件

模板

原料

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

酶

DNA聚合酶

能量

引物

ATP RNA 催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

［思考］细胞内DNA复制除满足以上条件外，还具体涉及到DNA双链的方向，那如何来判断方向呢？

1．2细胞内DNA复制过程

子链延伸的方向

（1）DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为 3’ ，而将磷酸基团末端称为 5’ 。DNA聚合酶不能 从头 合成DNA，而只能从 延伸DNA，因此DNA复制需要 引物 。

（2）DNA的合成方向总是从子链的 5’ 向 3’

延伸

［思考］根据细胞内DNA复制需要的组成成分和条件，PCR技术是如何解决这些问题呢？

1、如何在体外将双链打开？

2、如何解决温度对DNA聚合酶的影响？

3、如何合成双链DNA？

1．3 PCR扩增DNA与体内DNA复制条件对比

PCR复制条件：,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物（0～30个核苷酸构成DNA或RNA、缓冲液、严格控制温度（PCR仪）

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）

4．PCR的反应原理

DNA 分子的热变性原理：在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。

DNA双链

复性（缓慢冷却）

5.反应过程

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

6.反应结果：①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸

②

DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

变性

复性

延伸

变性（加热80-100℃）

DNA单链

2．PCR实验操作

2．1

PCR设备及用具

PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2．2 实验操作步骤

①准备：按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。

②移液：

用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。

③混合：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。

注意：A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。

2．3 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

5．结果分析与评价

实验中DNA含量测定

原理：可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

（三）课堂总结、点评

（四）习题练习

多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数