课题3　分解纤维素的微生物的分离教学实录及点评

课题三 分解纤维素的微生物的分离

一、纤维素与纤维素酶

1．纤维素

(1)化学本质：由C、H、O三种元素组成，基本组成单位是葡萄糖，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

(2)分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外木材、作物秸秆等也富含纤维素。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

(2)作用原理

纤维素――――――→纤维二糖―――――――→葡萄糖

二、纤维素分解菌的筛选阅读教材P28

1．方法：刚果红染色法。

2．原理

C1酶和CX酶葡萄糖苷酶

三、实验设计和操作

1．土壤取样：选择富含纤维素的环境。

2．选择培养

(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

3．刚果红染色法

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

方法二：在倒平板时就加入刚果红

四、课题延伸——纤维素分解菌的鉴定

阅读教材P30

1

1．为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

2．纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

1．纤维素酶的种类和作用是什么？

2．纤维素分解菌的筛选方法和筛选原理是什么？

3．鉴别纤维素分解菌的原理是什么？

4．纤维素分解菌的分离过程是怎样的？

5．纤维素酶的测定方法是什么？

探究点一

[共研探究]

纤维素分子的结构如图所示，结合教材回答下列问题：

纤维素分解菌筛选的原理

1．纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物产生的纤维素酶分解。

2．纤维素酶

(1)纤维素酶是一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

(2)纤维素酶作用过程

纤维素――――――→纤维二糖――――――→葡萄糖

3．纤维素分解菌的筛选

(1)利用刚果红染色法筛选纤维素分解菌。

(2)刚果红染色法筛选的原理是什么？

提示：

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶2

[总结升华]

1．纤维素酶作用的实验验证

缓冲液

pH＝4.8 纤维素酶

(70～

80 U/mL) 将两支试管固定10 mL 1 mL 在50 mL的锥形瓶中，在摇床上2 1 cm×

6 cm 11 mL －

以140 r/min的转速振荡反应1 h 2.两种刚果红染色法的比较

项目

内容

方法一

培养基上长出菌落→覆盖质量浓度为1 mg/mL的CR溶液10～15 min试管

滤纸条

条件

结果

1 1 cm×

6 cm 完全

分解

基本无

变化

方法二

配制CR溶液→灭菌→按照1 mL CR/200 mL培养基比例混匀→倒平板→培养→出现透明圈

过程

――→倒去CR溶液→加入

15 minNaCl溶液――→倒掉NaCl溶液

→出现透明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

制作烦琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

操作简便，不存在菌落混杂问题

缺点

【知识拓展】

容易出现假阳性反应

(1)方法一中加入NaCl溶液的作用：洗去未和纤维素结合的刚果红染液，留下大大小小的透明圈(透明圈较大说明纤维素分解菌分解纤维素能力较强)。

(2)方法二中出现假阳性反应的原因：

①由于纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使产生淀粉酶的微生物也3

形成透明圈，即出现假阳性反应。

②有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈。

板时就加入刚果红，在长期培养过程中刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈。

探究点二

[共研探究]

1．分析本课题使用的两种培养基的配方回答问题：

配方1：纤维素分解菌的选择培养基

培养基组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

含量

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 实验设计与操作提示

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL

配方2：鉴别纤维素分解菌的培养基

培养基组分

CMC-Na 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

含量

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL (1)配方1所示培养基按物理性质划分属于液体培养基，因为没有加入琼脂(凝固剂)；按功能划分属于选择培养基，该培养基的主要碳源为纤维素粉，只有能分解该物质的微生物才能生存。

(2)配方2所示培养基按物理性质划分属于固体培养基，按功能划分属于鉴别培养基，在该培养基中加入刚果红溶液，在纤维素分解菌的周围会形成透明圈。

(3)若要设置对照实验说明选择培养的作用，应将配方中的纤维素粉换成葡萄糖。

2．完善分离纤维素分解菌的实验流程图

4

[总结升华]

1．筛选纤维素分解菌的注意事项

(1)为确定得到的细菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产生纤维素酶的实验。因为形成透明圈的菌落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌种。

(2)流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。

(3)本实验的流程与课题2的流程有一定的区别。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。

【归纳拓展】

尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定的比较

项目

条件

鉴定方法

鉴定原理

尿素分解菌的分离与鉴定

尿素为唯一氮源

在培养基中加入酚红指示剂

分解纤维素的微生物的分离与鉴定

纤维素为主要碳源

在培养基中加入刚果红溶液

微生物产生的纤维素酶能使纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使刚果红－纤维素复合物无法形成而出现透明圈

土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养→挑取菌落

细菌合成的脲酶使尿素分解成氨，氨使培养基pH升高，酚红指示剂变红

土壤取样→样品梯度稀释→涂布平板→培养与观察

步骤

2.结果分析与评价

(1)培养基的制作是否合格：

5

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。

(2)选择培养基是否筛选出目的菌：如果鉴别培养基中观察到了产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

(3)分离的结果是否一致：

能够分解纤维素的微生物种类很多，不仅有细菌，还有霉菌、放线菌等。这些微生物的菌落特征各不相同，分解纤维素的能力也不相同，所以形成的菌落大小、形态以及透明圈的大小并不相同。由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是能够分解纤维素的细菌。但由于所取土样的环境不同，也可能得到能够分解纤维素的真菌和放线菌等不同的分离结果。

【易错易混】

对两种对照培养基的正确理解

判断某个选择培养基是否具有选择作用时，应设立基础培养基进行对照；若判断所使用的培养基灭菌是否彻底，应设立不接菌种的该种培养基进行空白对照。

1．下列有关分解纤维素的微生物的分离实验的叙述，错误的是(

) A．纤维素酶是一种复合酶

B．在倒平板时加入刚果红不需要灭菌

C．纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵

D．纤维素酶的测定方法一般是对其分解纤维素所产生的葡萄糖进行定量的测定

解析：选B

纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶；刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌；纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵；纤维素酶的测定方法一般是对其催化产物葡萄糖进行定量的测定。

2．分解纤维素的微生物的分离实验的具体操作步骤是(

) ①土壤取样

②将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

③挑选产生透明圈的菌落

④选择培养

⑤梯度稀释

A．①④⑤②③

C．①⑤④③②

B．①⑤②④③

D．①③⑤④②

解析：选A

分解纤维素的微生物的分离实验的具体操作步骤是：①土壤取样→④选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→⑤梯度稀释→②将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→③挑选产生透明圈的菌落。

3．纤维素分解菌的筛选原理是(

) A．刚果红可以与纤维素形成红色复合物

6

B．刚果红可以与分解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物

C．刚果红可以与纤维素酶形成红色复合物

D．刚果红可以与纤维素分解菌结合形成红色复合物

解析：选A

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和分解后的纤维二糖及葡萄糖发生这种反应，也不与纤维素酶或纤维素分解菌结合形成红色复合物。

4．研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物。请回答下列有关问题：

(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和____________酶。

(2)如果要对土壤中的纤维素分解菌进行计数，常采用____________法进行接种培养，接种工具采用__________________________________的方法灭菌。

(3)常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在________时就加入刚果红。________(填“第一种”或“第二种”)方法会使菌落之间发生混杂。

(4)如果观察到产生________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行________________的实验。纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。

解析：(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)若对菌株进行计数，常采用稀释涂布平板法进行接种，此过程所用的接种工具是涂布器，灭菌时采用沾少量酒精，在火焰上引燃的方法。(3)常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在倒平板时就加入刚果红。第一种方法会使菌落之间发生混杂。(4)如果观察到产生透明圈的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

答案：(1)葡萄糖苷

(2)稀释涂布平板

沾少量酒精，在火焰上引燃

(3)倒平板

第一种

(4)透明圈

发酵产纤维素酶

葡萄糖

【基础题组】

1．下列关于纤维素的叙述，错误的是(

) A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物

B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能产生纤维素酶

C．植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素

7

D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而为生物体提供能量

解析：选D

自然界中只有部分能够合成纤维素酶的生物才能分解纤维素。

2．使用刚果红染色时，加入刚果红应在(

) ①制备培养基时

②梯度稀释时

③倒平板时

④涂布时

⑤长出菌落时

A．①③

C．③⑤

B．②⑤

D．④⑤

解析：选C

常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，长出菌落后再加入刚果红进行颜色反应；另一种是倒平板时就加入刚果红。最终两种染色法都可以在培养基上观察到以纤维素分解菌为中心的透明圈。

3．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在(

) A．加入指示剂的鉴别培养基上

B．含有蛋白胨的固体培养基上

C．只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上

D．含四大营养要素的培养基上

解析：选C

选择纤维素分解菌的培养基中应含有该种

菌生长发育所需的营养条件，且其他菌种在这种培养基中不能生存。

4．在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前一般先进行选择培养，其主要目的是(

) A．分离纤维素分解菌

B．加快纤维素分解菌的生长速度

C．使纤维素分解菌均匀地分布在稀释液中

D．增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物

解析：选D

纤维素分解菌的选择培养基中富含纤维素，主要适合于能产生纤维素酶的纤维素分解菌的生长，所以选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。

5．在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是(

) A．刚果红与纤维素形成的复合物

B．刚果红与纤维二糖形成的复合物

C．纤维素分解后形成的葡萄糖导致的

D．以纤维素分解菌为中心形成的

解析：选D

刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，但并不和分解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

6．在纤维素分解菌的鉴定实验中，纤维素酶的测定方法一般是(

) 8

A．对纤维素进行定量测定

B．对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定

C．对纤维素酶分解纤维素后所产生的纤维二糖进行定量测定

D．对纤维素分解菌进行定量测定

解析：选B

在纤维素分解菌的鉴定实验中，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

7．在分离纤维素分解菌过程中往往需要振荡，其作用不包括(

) A．使纤维素分解菌与培养基混合均匀

B．使纤维素分解菌能充分吸收氧气

C．使纤维素分解菌能快速繁殖

D．防止纤维素分解菌失水

解析：选D

振荡的作用是使细菌与培养基充分接触，并充分吸收氧气，从而使其生命活动旺盛，繁殖加快。

8．下列有关纤维素分解菌分离实验的叙述，错误的是(

) A．该实验过程中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度

B．将分离得到的菌种接种在加入伊红美蓝的鉴别培养基上

C．当纤维素被纤维素分解菌释放的酶分解后，培养基上会出现透明圈

D．一般用刚果红染色法鉴别纤维素分解菌

解析：选B

通过选择培养可以增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；将分离得到的菌种接种到选择培养基上；纤维素被纤维素分解菌释放的酶分解后，培养基上会出现透明圈；纤维素分解菌常用刚果红染色法进行鉴定。

【能力题组】

9．下列关于纤维素酶的叙述，错误的是(

) A．纤维素酶是一种复合酶，能将纤维素分解为葡萄糖

B．纤维素酶的组成单位是氨基酸

C．纤维素酶在微生物细胞内合成并发挥作用

D．筛选可产生纤维素酶的微生物，应在富含纤维素的环境中取土样

解析：选C

纤维素酶由C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶组成，其中C1酶、CX酶可将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解为葡萄糖；纤维素酶的化学本质是蛋白质，基本组成单位为氨基酸；纤维素酶在微生物细胞内合成，分泌到细胞外分解纤维素；筛选可产生纤维素酶的微生物，应在富含纤维素的环境中取土样。

10．如表为某培养基的配方，有关叙述正确的是(

) 成分

纤维素粉

Na2HPO4·7H2O NaNO3

KH2PO4

9 MgSO7H24·KCl 酵母膏

水解酪素

O 含量

5 g 1.2 g 1 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g A.此培养基为鉴别培养基

B．此培养基上能生长分解尿素的细菌

C．此培养基属于固体培养基

D．在此培养基上能生长的细菌可产生纤维素酶

解析：选D

该培养基中主要碳源为纤维素粉，因此为筛选纤维素分解菌的选择培养基，因该培养基中没有加琼脂，因此不属于固体培养基。

11．使用液体选择培养基培养纤维素分解菌的目的是(

) ①用液体选择培养基可获得大量纤维素分解菌

②用液体培养基便于稀释涂布平板

③纤维素分解菌只能在液体培养基中生长

④用液体培养基可鉴别纤维素分解菌

A．①②

C．②④

B．①③

D．③④

解析：选A

使用液体选择培养基培养纤维素分解菌，一方面可以获得大量的纤维素分解菌，另一方面便于稀释涂布平板。纤维素分解菌也可以在固体培养基上生长；鉴别纤维素分解菌使用的是固体培养基。

12．下列有关纤维素分解菌分离实验的说法错误的是(

) A．刚果红不能与纤维素分解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物

B．在用刚果红染色时既可以先培养微生物再加入刚果红，也可以在倒平板时直接加入

C．该实验需用到选择培养基和鉴别培养基

D．在用刚果红染色过程中，若将微生物培养在事先加入刚果红的培养基上，则出现透明圈的菌落一定为所需菌种

解析：选D

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解成纤维二糖和葡萄糖后，红色复合物无法形成；刚果红染色有两种方法，一种是先培养微生物再加入刚果红，另一种是在倒平板时就将刚果红染液加入培养基中，然后再培养微生物；该实验富集纤维素分解菌时需要选择培养基，筛选时需要鉴别培养基；有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，因此出现透明圈的菌落不一定为所需菌种。

13．(2018·石家庄质检)为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。

10

(1)配制好的培养基通常使用______________法灭菌。步骤③与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是步骤③培养基中______________________。

(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是____________________，出现图B结果可能的失误操作是______________________。

(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为________个。

(4)步骤⑤需要振荡培养，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：(1)使用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。步骤③与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是步骤③中使用的培养基内石油是唯一碳源。(2)根据图B所示平板经培养后的菌落分布可知，该同学的接种方法是稀释涂布平板法。平板上菌落聚集分布，出现这种结果可能的失误操作是涂布不均匀。(3)每升样品中的活菌数＝(56＋57＋58)/3×10×100×1 000＝5.7×107(个)。(4)振荡可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，并且提高培养液中(溶解)氧的含量。(5)为了筛选出分解石油能力最强的细菌，步骤⑤后取样测定石油含量，选取石油含量最低的菌种作为分解石油能力最强的菌株。

答案：(1)高压蒸汽灭菌

石油是唯一碳源

(2)稀释涂布平板法

涂布不均匀

(3)5.7×107

(4)提高培养液中(溶解)氧的含量，通过振荡可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率

(5)筛选出分解石油能力最强的细菌

14．莠去津是一种含氮农药，在土壤中不易降解，为修复被其污染的土壤，可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。请据图回答(已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明)：

(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的过程称为________，目的是________________________________________________________________________。

(2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行________，将菌种接种到固体培养11

基的方法有平板划线法和______________法，从图中看本实验采用的是________(填“前者”或“后者”)。

(3)一段时间后，培养基出现无透明圈和有透明圈两种菌落，筛选的目的菌是____________菌落中的细菌，该菌落生长所需的氮元素主要来源于________。

(4)为弄清固体培养基中的非目的菌是来自C瓶菌种还是培养基，应如何设置对照组？________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：(1)图中从A瓶到C瓶液体培养过程为选择培养，目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并增加其数量。(2)将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种，由图中固体培养基上的菌落分布比较均匀可知，该接种方法是稀释涂布平板法，包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(3)根据题目信息“莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明”可知，能够降解莠去津的目的菌可分解莠去津，使菌落周围出现透明圈，因此选择菌落周围存在透明圈的细菌。由于培养基中只有莠去津一种氮源，因此分解莠去津的微生物所需的氮源主要由莠去津提供。(4)为弄清固体培养基中的非目的菌是来自C瓶菌种还是培养基，应设置灭菌后不接种菌种的空白培养基进行对照，两种培养基放在相同条件下培养，若空白培养基上无菌落出现，则非目的菌一定来自C瓶菌种，若空白培养基上出现菌落，则说明非目的菌可能来自培养基。

答案：(1)选择培养

初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并增加其数量

(2)梯度稀释

稀释涂布平板

后者

(3)有透明圈

莠去津

(4)配制的培养基灭菌后不接种菌种，与实验组放在相同条件下培养

15．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。

(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

12

(3)右图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。

(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________________________________________________________________________。

管号

苯酚浓度(mg/L) 1

2

3

4

5

6 1 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5

②10

③20)倍后，再进行比色。

解析：(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加凝固剂(如琼脂)。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。

答案：(1)蛋白胨、苯酚

(2)增加

稀释涂布

凝固剂

(3)③

(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③

13