课题3　分解纤维素的微生物的分离教学设计模板

分解纤维素的微生物的分离

(1)纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用

纤维素――→纤维二糖―――――→葡萄糖

C酶XC1酶葡萄糖苷酶(2)纤维素分解菌的筛选

①原理

纤维素分解菌

↓

刚果红纤维素酶→红色复合物――→红色消失，出现透明圈

纤维素②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程

土壤取样：富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓

梯度稀释：制备系列稀释液

↓

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落

[诊断与思考]

1.判断下列说法的正误

(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(

×

) (2)从物理性状的角度看，选择培养基多属于固体培养基(

√

) (3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(

×

) (4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(

√

) (5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(

×

) (6)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，在纤维素酶的作用下，纤维素可以水解成葡萄糖(

√

)

(7)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(

×

) (8)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度(

√

) (9)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红(

×

) 2.一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起，如何将自养微生物选择出来？

提示

用不含有机碳的培养基进行培养，因为自养微生物可以利用空气中的CO2而异养微生物不可以，所以能在培养基中生存的就是自养微生物。

3.2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？

提示

配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。

4.为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？

提示

由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。

5.在分离纤维素分解菌的操作中，选择培养和鉴别培养的目的分别是什么？从物理性质的角度看，两种培养基分别是哪种培养基？

提示

选择培养的目的是增大纤维素分解菌在样品中的浓度，鉴别培养的目的是筛选出纤维素分解菌。选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基属于固体培养基。

题组一

选择培养基成分及配制方法的分析

1.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

) A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基

B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基

C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基

D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基

答案

B 解析

酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生

长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。

2.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用____________________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于

________________________________________________________________________；

使用______________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是__________________________________________________________ ______________________________________________________________________________。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？

________________________________________________________________________。

答案

(1)苯酚

A

稀释涂布平板

(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入了苯酚作为碳源

稀释涂布平板法或平板划线

防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基

(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作

解析

根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长，抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用稀释涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落，再接种培养即可获得纯目的菌。为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长，所以要将培养皿倒置。在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则，操作中要严格进行无菌操作。

题组二

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

3.下表是某同学列出的分离土壤中微生物培养基的配方，据此回答下列问题：

培养基配方

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 1.4g 2.1g 0.2g

葡萄糖

尿素

琼脂

10.0g 1.0g 15.0g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL

(1)从作用上看，该培养基属于________培养基，提供氮源的物质是________，细菌能利用该氮源是由于体内能合成________酶。

(2)在对分离的能分解尿素的细菌进行鉴定时，还需在培养基中加入________指示剂，若指示剂变________，说明有目的菌株存在。

(3)为了测定微生物的数量，接种时应采用__________________法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1mL，培养后菌落数分别为180、155、176、129个，则每毫升原土壤样液中上述微生物的数量为________，测定的活菌数比实际活菌数________(填“低”“高”“基本一致”)。

答案

(1)选择

尿素

脲(催化尿素分解的) (2)酚红

红

(3)稀释涂布平板

1.6×109

低

解析

(1)题干指出表中是分离土壤中微生物的培养基配方，其中尿素是唯一氮源，能生长的菌落说明能利用尿素中的氮源，所以甲从用途上属于选择培养基。以尿素为唯一氮源的培养基可以选择尿素分解菌。(2)在对分离的能分解尿素的细菌进行鉴定时，还需在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，说明有目的菌株存在。(3)纯化微生物可以用稀释涂布平板法和平板划线法，其中稀释涂布平板法能用于微生物的计数。1mL原土壤样液中上述微生物数量＝(180＋155＋176＋129)÷4×106×10＝1.6×109个；用稀释涂布平板法进行微生物的计数，但统计的数量比实际数量会偏少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

题组三

分解纤维素的微生物的分离

4.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列相关问题：

(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分形成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将______________分解成______________。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)染料时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。

(3)为从富含纤维素分解菌的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落并加以鉴定，某同学设计了甲、乙两种培养基：

酵母膏

无机盐

淀粉

纤维素粉

琼脂

CR溶液

水

培养基甲

培养基乙

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

－

－

＋

＋

＋

＋

＋

注：“＋”表示“有”，“－”表示“无”。

据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离纤维素分解菌，原因是__________________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于鉴定纤维素分解菌，原因是__________________________________________。

答案

(1)纤维二糖

葡萄糖

(2)红

透明圈

(3)不能

液体培养基不能分离单菌落

不能

培养基中没有纤维素(不能形成CR－纤维素红色复合物) 解析

(1)葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌分离和鉴别培养基属于固体培养基，而培养基甲中没有琼脂，是液体培养基，要分离和鉴别纤维素分解菌，需要以纤维素为唯一碳源的培养基，培养基乙没有纤维素，不能形成CR－纤维素红色复合物，无法鉴定纤维素分解菌。

1.选择培养基的制作方法

(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。

(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。

2.稀释涂布平板法计数微生物的注意问题

用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。解题时易出

现以下误解：

(1)只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶发因素的影响。

(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：

①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”之间，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。

②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。

可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。

3.两种微生物筛选方法的比较

项目

方法

土壤中分解尿素的细菌的分离

使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养

土壤中不能分解尿素的微生物因原理

缺乏脲酶而不能正常生长，能够分解尿素的微生物能利用尿素为氮源正常生长，从而起到选择作用

特有

代表

过程

要语强记

1.无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。

2.培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。

3.大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。

4.微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。

5.尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。

CO(NH2)2＋H2O――→CO2＋2NH3

脲酶分解纤维素的微生物的分离

利用富含纤维素的选择培养基进行培养

因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖

纤维素――→

纤维二糖――→葡萄糖

葡萄糖苷酶C1酶、CX酶探究高考

明确考向

1.(2015·江苏，19)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(

) A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖

B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上

C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落

D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上

答案

D 解析

A项错，高压灭菌加热结束后，让其自然冷却，待压力表的压力降到零时，再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物；B项错，倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖；C项错，灼烧接种环之后，要在火焰旁冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；D项对，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。

2.(2013·江苏，18)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是(

) A.培养基分装到培养皿后进行灭菌

B.转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线

C.接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养

D.培养过程中每隔一周观察一次

答案

B 解析

培养基灭菌后再分装到培养皿中；转换划线角度后要灼烧接种环，冷却后再从上次划线的末端开始进行划线；接种后的培养皿必须放在恒温箱中进行培养，一般每隔12h或24h观察一次。

3.(2012·北京，5)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是(

) A.将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中

B.将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上

C.将转基因植物叶片接种到无菌培养基上

D.将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

答案

C 解析

在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无

菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外植体的生长，甚至杀死外植体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果影响也不会太大。

4.(2015·全国Ⅰ，39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：

(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用______________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。

(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。

(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用____________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用____________________法进行计数。

(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，________℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________℃设计后续实验。

答案

(1)苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)

萃取法

(2)油脂

(3)血细胞计数板

稀释涂布平板

(4)45

40 解析

(1)生物组织中的油脂能被苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)染成橘黄色(或红色)。(2)为了筛选出能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，我们应选用只能让该菌落生长的选择性培养基，因此培养基中只能选用油脂作为唯一碳源的固体培养基。(3)血细胞计数板可用于直接计数培养液中的菌体数，但是不分死活，因此要计数活菌数量要通过稀释涂布平板法来计数。(4)温度影响酶的活性，在三个温度中，45℃需酶量最高，说明酶活性最低；在三个温度实验中40℃所需酶量最少，低于35℃和45℃所用酶量，说明酶的最适温度介于35℃和45℃之间，因此应围绕40℃设计不同温度梯度，进行后续实验。