课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第二课时教案

【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】

一、研究思路

1．筛选菌株

尿素是一种重要的

肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成

。可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、 、pH等)，同时____ _或 其他微生物生长。

(2)选择培养基：在微生物学中，将允许 的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

2．统计菌落数目

(1)常用来统计样品中 数目的方法是__________ _______。即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中 。通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。

通常统计出的菌落数比活菌的实际数目 。这是因为 。因此，统计结果一般用 而不是活菌数来表示。

(2) 也是测定微生物数量的常用方法。

(3)细菌的数目还可以通过 法来测定。例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将 的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 色，可以根据培养基上 的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。在该实验中至少应取_ __个水样。

3．设置对照

(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的 。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。

(2)对照实验是指除了 的条件外，其他条件都 的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

二、实验设计

实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的 以及时间安排等的综合考虑和安排。关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：

1．土壤取样

土壤微生物约70%～80%为 ，主要分布在距地表

的近 性土壤中。 2．样品的稀释

样品的稀释程度将直接影响平板上生长的 。由于不同微生物在土壤中含量不同，因此分离不同的微生物要选用不同的稀释度范围，以保证获得_____________ _________、适于计数的平板。一般来说，细菌稀释度为_____________倍，放线菌稀释度为 倍，真菌稀释度为 倍。第一次实验时，可将稀释范围放宽些，以保证能从中选择出适于计数的平板。

3．微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。细菌一般在 ℃培养 d，放线菌一般在25～28 ℃培养5～7 d，霉菌一般在 ℃的温度下培养 d。

在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取____________ 时的记录作为结果，以防止因_________________而导致遗漏菌落的数目 。

一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落的特征包括 等方面。

三、对分离得到的分解尿素细菌的鉴定

在对能分解尿素的细菌进行初步筛选后，还需要借助生物化学的方法对分离的菌种作进一步的鉴定。在细

菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_____ _将尿素分解成了___ _。氨会使培养基的碱性 ，pH 。因此，我们可以通过检测培养基 变化来判断该化学反应是否发生。在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变 ，说明该细菌能够 。

【分解纤维素的微生物的分离】

一、纤维素与纤维素酶

1．纤维素的化学组成：纤维素是一种由

首尾相连而成的

化合物，是含量最丰富的

类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生

。

2．纤维素的分布： 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

3．纤维素酶的作用：纤维素酶是一种 酶，一般认为它至少包括三种组分

。它催化纤维素分解的过程如下：

纤维素

酶、

酶

酶―――→

――→葡萄糖

二、纤维素分解菌的筛选

1．筛选方法： 法。这种方法能够通过

直接对微生物进行筛选。

2．筛选原理：刚果红是一种 ，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成 ，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，培养基中出现以 为中心的 ，我们可以通过 来筛选纤维素分解菌。

三、实验设计

1．土壤取样

采集土样时，应选择

的环境。

2．选择培养

为了增加纤维素分解菌的 ，确保能够从样品中分离到所需微生物，可对样品进行 培养。

将土样加入装有 培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变 。可重复选择培养。

3．梯度稀释

4．将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

常用的刚果红染色法有两种，一种是先 ，再 ，另一种是在 时就加入刚果红。

5．挑选产生 的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行________________实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和____ 发酵两种。纤维素酶测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 含量进行定量测定。