课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教学设计

专题5

DNA和蛋白质技术

课题3

血红蛋白的提取和分离

一、课题目标

本课题通过描述对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

二、课题重点与难点

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

三、课题背景分析

课题背景通过当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，进而明确地提出课题目的：以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。

四、基础知识分析与教学

（一）凝胶色谱法

知识要点：1.凝胶色谱法的用途；2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理。

教学：在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可以结合教科书提供的插图，让学生对凝胶色谱法分离蛋白质的过程有一个直观的认识。可以通过发动学生查阅资料，让学生了解有关凝胶色谱法的知识，如凝胶的种类、理化性质及凝胶的选择和保存，并结合实验操作，让学生分析实验中的注意事项。还可以向学生介绍凝胶色谱法的其他用途，如测定生物大分子的分

子量、蛋白质的脱盐等。

（二）缓冲溶液

知识要点：1.缓冲溶液的组成和作用机理；2.熟悉一般缓冲溶液的配制方法；3．缓冲溶液广泛应用于生化实验、微生物的培养、组织切片和细菌染色以及酶的研究等方面。

教学：首先可以结合生活中的一些缓冲现象，让学生充分理解缓冲溶液的重要性。在进行本课题的实验操作之前，可以让学生查阅相关资料，练习一些常用缓冲液的配制。

（三）电泳

知识要点：1.电泳的基本原理；2.不同类型的电泳。

教学：电泳技术广泛应用于生化实验，在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有较高的分辨率。可以通过一个简单的实验使学生理解电泳现象，比如在盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口，各插入一个电极。通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐变深，阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下，带电粒子发生迁移的现象就叫做电泳。

教科书中用楷体字简单地介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，可以结合资料，开拓学生的知识面，围绕聚丙烯酰胺凝胶电泳，介绍其他类型的电泳原理及应用。本实验的选做部分是通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对血红蛋白进行纯度的鉴定，同时也可以测定血红蛋白亚基的分子量。此外，还可以通过聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳来测定天然蛋白的分子量；通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳来测定蛋白的等电点；等等。相关原理可以查阅生物化学技术的有关书籍。

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量

的标准蛋白试剂出售。

五、教学过程

1、蛋白质分离的原理

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

（一）凝胶色谱法（分配色谱法）

概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。

凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。

凝胶色谱法的原理：学生阅读课本后回答

（二）缓冲溶液

作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液酸碱度的影响，维持酸碱度基本不变。

本课题使用的缓冲液：磷酸缓冲液

成分：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠

问题：如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？

（三）电泳

概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、

核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

类型

介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及使用方法

2、实验操作

样品处理粗分离纯化纯度鉴定

血液中成分：

选材讲解

用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

（1）红细胞的洗涤

a、去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

b、洗涤操作

1、采集血样。

2、低速短时间离心

3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。

4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤(生理盐水)。

5、低速离心（低速短时间）

6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。

（2）血红蛋白的释放

阅读思考：

1.

释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？

2.

为了加速释放过程，采取了什么措施？

（3）分离血红蛋白溶液

过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。

试管中溶液层次：

第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；

第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；

第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；

第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。

分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

（4）透析

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

六、作业布置