课题3　血红蛋白的提取和分离第二课时教学实录

电性质和数量相同，但蛋白质的分子大小不同，则蛋白质在电场中的迁移情况是 ② 。叶绿体色素分离使用的支持物是 ③ ，电泳分离蛋白质使用的支持物是 ④ 。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于 ⑤ 。

二）、实验操作

1.分析与样品处理有关的问题：

（1）分离红细胞离心速度不能过高和时间过长的原因是

①

。洗涤红细胞的目的是 ② 。用生理盐水洗涤红细胞的原因是 ③ 。洗涤次数不能过少的原因是 ④ 。洗涤成功的标志是 ⑤ 。

（2）在红细胞液中加入蒸馏水的目的是

①

，甲苯的作用是 ② ，充分搅拌的目的是 ③ 。

①

②

（3）将血红蛋白从混合液中分离出来所使用的方法是 ① 。右图是分离结果示意图，图中①②③④的物理性质分别是

②

，主要成分分别是 ③

④

③ 。将血红蛋白从中分离出来要经过 ④ 过滤和 ⑤ 分离两步。

（4）右图装置用于 ① ，其目的是 ② 。若B是血红蛋白溶液，则A是 ③ 。

透析袋

2.以下是凝胶色谱柱的制作过程图解，正确的顺序是 ① 。

A

B

打孔

安装

玻璃管

挖出凹穴

a b c d e f

3.右图是装填的凝胶色谱柱，据图分析：

（1）图中“G”表示 ① ，75表示 ② 。加入前需放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀，可用沸水浴加热，这样不但可以节约时间，而且可以 ③ 。

（2）装填凝胶时要先打开[a ] ① ，然后一次性倒入并轻轻敲动色谱柱，目的SephadexG-7是 ② 。装填过程中若发现有气泡存在，必须重装，因为气泡会 ③ ，降低分离效果。

（3）装填完后，为了使凝胶装填紧密，还需使用 ① 充分洗涤平衡凝胶12h。该过程中出现何种现象需要重新装填凝胶色谱柱？ ② 。

4.下图A是样品的加入示意图，图B是洗脱示意图。

a e

样操样作品

品

压

a b c d

A B

2

（1）加样前需先让凝胶面上的缓冲液下降至与凝胶面平齐，操作方法是 ① 。加样时正确的操作次序是 ② 。

（2）洗脱液e是 ① ，洗脱时要打开 ② ，待 ③ 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液。

（3）如何确定色谱柱的制作是成功的？ ① 。

特别提醒：血红蛋白提取和分离的实验结果分析与评价(见下表) 项目

①分层明显→样品处理完成

血液样品的处理

②分层不明显的原因洗涤次数少，未能除去血浆蛋白离心速度过高或时间过长

①放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查凝胶是否装填得均匀

凝胶色谱柱的装填

②加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖一2 000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功

①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功

血红蛋白的分离

②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽→分离效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关

【课堂巩固】

1.下列有关血红蛋白提取和分离实验的叙述错误的是（ ）

．．A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C.通过凝胶色谱法可除去杂质蛋白，即样品的纯化

D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

2.从细胞中提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大，其原因不是( )

A．蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件更敏感，更易失活

B．蛋白质的空间结构多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有统一的方法

C．提取某种特定的蛋白质需据其特性摸索提取的程序

D．提取血红蛋白程序可分为样品处理、粗分离、纯化、纯度的鉴定四大步

3.下列操作正确的是（ ）

A．分离红细胞时采用低速长时间离心

B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h

4.下列关于电泳的说法中，正确的是（ ）

A．电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程

B．电泳的过程要在一定的pH下，所以一定要使用缓冲液

C．葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法

D．聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，电泳的迁移率主要取决于分子所带电荷的多少和相对分子质量的大小

5.下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是（ ）

A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性

B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来

3

分析

C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离

D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相同的电极方向移动

6．样品的加入和洗脱的操作不正确的是

A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

7．在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲溶液，起到的作用是

A.使酶的活性最高

B.使蛋白质的活性最高

C.维持蛋白质所带电荷

D.使蛋白质带上电荷

8.凝胶色谱法是一种快速而又简单的分离技术，请据图回答相关问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，

原因是 。

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。

（3）凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗? 。图中a和b的分离度与凝胶色谱柱的高度有关吗? 。

（4）在哪些情况下需要重装凝胶色谱柱？ 。

（5）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体

(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是

。

（6）对样品进行粗分离的方法是 ，纯化的方法是 。判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯化的鉴定。在鉴定的方法中使用最多的是 凝胶电泳。

4

○·○·○ ··○

a ···○

○

b ○

c

d