课题3　血红蛋白的提取和分离教案评析

选修一《血红蛋白的提取与分离》教学设计

晋江市侨声中学

黄爱清

一、课题的目标：

通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，理解色谱法、电泳法原理；

二、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法

三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、教学方法：多媒体辅助教学，课件+视频+评测卷

五、教学过程：

I引入：

介绍血红蛋白特点：血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。

思考1：

“课题1--DNA的粗提取与鉴定”

实验理想的材料是什么？

“课题3--血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？

答案：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。

II新课教学：

一、基础知识：

（一）蛋白质分离原理

1

蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少

3.溶解度

4.吸附性质

5.对其他分子亲和力

（二）蛋白质分离的方法

1、凝胶色谱法：又称分配色谱法

凝胶：多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子筛）

原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（

）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（

），移动速度（

），而（

）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（

）移动，路程（

），移动速度（

），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

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【观看视频1】

随堂练习巩固：

1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是

A、相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质

B、相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质

C、相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质

D、二者根本无法比较

2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个

3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是(

) 3

A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径

B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C.将酶或细胞固定在凝胶中

D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

2、电泳法

电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

1）原理：

不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

2）影响蛋白质分子运动速度的因素

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

决定运动方向

决定运动速率

3）常用电泳方法：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳

介绍：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量

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SDS 带负电荷多的

，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

思考：

电泳是分离鉴定蛋白质的常规方法。图为几种蛋白质通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的图谱，据图，你认为相对分子质量最大的蛋白质是________，依此推理该样品在凝胶色谱法中最后流出的蛋白质应该是________________。

（三）缓冲液的作用

缓冲溶液－－洗脱剂

（1）作用：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持

pH稳定。

（2）配制：由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如HCO/NaHCO，NaHPO/NaHPO2332424等

（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用缓冲液的原因？

目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。

二、实验操作——实验步骤：

1、样品处理：

阅读思考1：血液组成成分

1.

血液由______和________两部分组成。

2.

血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。

3.

该化合物是由

_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。

（1）洗涤红细胞

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阅读思考2：（1）洗涤的目的是什么？

（2）洗涤的方法是什么？

（3）洗涤干净的标志是什么？

（2）释放血红蛋白

阅读思考3：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？

目的分析：

1.

蒸馏水的作用是______________________________。

2.

加入甲苯的作用是____________________________。

3.

充分搅拌的目的是____________________________ （3）分离血红蛋白

2、粗分离：（4）透析血红蛋白

阅读思考4：透析的目的是什么？去除血红蛋白中的小分子杂质

透析袋介绍：指导读书P67

3、纯化：凝胶色谱法进行纯化

1.凝胶色谱柱的制作：指导读书P67-68 2.凝胶色谱柱的装填：

注意：

（1）凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀；凝胶装填时尽量紧密；装填时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密。

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3.样品的加入和洗脱

1.调液面

2.加样

3.再调液面

4.洗脱

5.收集

【观看视频

2】

4、纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

随堂练习巩固：

4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是(

)

A.使酶的活性最高

B.使蛋白质的活性最高

C.维持蛋白质所带的电荷

D.使蛋白质带上电荷

5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于

A

电荷的多少

B

分子的大小

C

肽链的多少

D

分子形状的差异

【注意事项】

1. 红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2. 凝胶的预处理：

沸水浴法，还能除去微生物和气泡

3.色谱柱的装填：

装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。

4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

随堂练习巩固：

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7.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是

A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

B、气泡阻碍蛋白质的运动

C、气泡与蛋白质发生化学反应

D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密

8.样品的加入和洗脱的操作不正确的是

A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

III结束课时：

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