课题3　血红蛋白的提取和分离教学实录与评析

课题3 血红蛋白的提取和分离

教学目标：

1.了解凝胶色谱法、电泳法的基本原理

2.尝试提取和分离血红蛋白

教学过程：

一、方法及原理

（一）凝胶色谱法

1、原理：根据相对分子质量的大小分离蛋白质

2、凝胶：多孔小球体，内部有许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成，如葡聚糖或琼脂糖。

3、用途：凝胶色谱法用于血红蛋白的分离和纯化。

4、过程：

（二）缓冲溶液

在一定范围内，抵制外界酸和碱对溶液pH影响，维持pH基本不变。在本课题中使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。

（三）电泳

1、电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2、原理：多肽、核酸等可解离的基团在一定的pH下会带上正电或负电。在电场地作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。利用待分离样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的不同，在电场作用下迁移速度不同，使各种分子得以分离。

电泳一般用于测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。

3、类型：琼脂糖凝胶电泳；聚丙稀酰胺凝胶电泳

4、举例：SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳

由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS作用下解聚成单条肽链 SDS与蛋白质结合使其带上负电，掩盖原蛋白质间的电荷差别。电泳迁移率完全取决于肽链分子的大小。分子量小迁移快；分子量大迁移慢。

课本P66图5-15。

二、实验操作程序

（一）样品处理

1、红细胞的洗涤

（1）目的：除去血浆蛋白等杂质，得到纯净的红细胞，有利于后续步骤的分离纯化。

（2）方法：低速离心（2min）→吸出上层黄色血浆→取红细胞液体→加入5倍体积的生理盐水→低速离心→反复洗涤3次→直至上层黄色血浆完全除去

注意要控制好离心速度和处理时间。离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞同时沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、血红蛋白的释放

（1）目的：使红细胞涨破，血红蛋白释放出来

（2）方法：加蒸馏水、甲苯，让红细胞破裂，释放出血红蛋白。

3、分离血红蛋白溶液

（1）目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的转化。

（2）方法：高速离心。明显看到试管中的溶液分为4层。（课本P67图5-18）

（二）粗分离（透析）

（1）目的：除去样品中分子量较小的杂质。

（2）方法：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0）透析 12 h。

（三）纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。

血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离的意义是：在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

（四）纯度鉴定：一般用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。

课后练习

一、单选题

1、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是

D A．防止血红蛋白被O2氧化

B．血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和

C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程

D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

【解析】

利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于分离观察(红色)和科学研究（活性）。

2．以下关于血红蛋白提取和分离的叙述正确的是

C

A．红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的自来水水，重复洗涤3次

B．将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9％的NaCl溶液中透析12h

C．凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在

D．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢

二、简答题

3．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：

（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：__________、__________、__________和__________。

（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①加入柠檬酸钠的目的是______________________________________________。

②以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞洗涤、________________、分离血红蛋白溶液。

③洗涤红细胞的目的_________________，你如何知道红细胞已洗涤干净？_______________ ______________________________________________。

④分离红细胞时对离心速度及离心时间要求分别是________________________________。

⑤如若离心速度过高和时间过长结果会怎样？

离心速度过高和时间过长会使

同时沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度

（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是_______________________________________________________________。

②透析的原理是________________________________________________________________。

（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是_______________________________________________________________。

②血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离的意义是：在凝胶色谱分离时可以通过观察____________来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常

，大大简化了实验操作。

4．（1）商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生

。

（2）利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：

Ⅰ中的主要成分为

；Ⅱ中包含多种酸酶等多种蛋白质。纯化得到植酸酶的方法及其依据是：①

法。根据蛋白质之间的

进行纯化。②

法。根据蛋白质之间的

进行纯化。

（3）为建设基因工程菌，可用PCR等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。PCR反应包含多次循环，每次循环包括三步：

。反应过程中打开模板DNA双链的方法是

。

5．某生物兴趣小组在学习完“蛋白质的提取和分离”后，联系相关实验准备从猪肝脏研磨液中初步提取过氧化氢酶，设计的“过氧化氢酶提取、分离流程图”如下，请回答下列有关问题：

（1）进行样品处理时可向肝细胞悬液中加入一定量的PH＝7.0的缓冲液并充分搅拌以破碎肝细胞，破碎细胞的原理是____________________________________________________。与使用蒸

馏水相比，使用缓冲液的优点是______________________________________________________。

（2）进行蛋白质粗分离时可以使用凝胶色谱法，该方法是根据________________________分离蛋白质的有效方法。进行蛋白质的纯度鉴定时常使用电泳。电泳利用了待分离样品中各种分子的_____________________________________等的差异而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。

响的探究，得到右图所示结果：

（3）实验小组以3％过氧化

氢溶液和获得的过氧化氢酶为

材料进行温度对酶催化活性影

根据实验结果得出“过氧化氢酶

能耐受100℃高温”的结论，请问这一结论是否可靠______________，原因是_____________________________________________________。

课后练习答案

1．D

2．C 3、（1）样品处理

粗分离

纯化

纯度鉴定

（2）①防止血液的凝固

②血红蛋白的释放

③去除杂质蛋白

离心后的上清液没有黄色

④低速500r/min；短时间如2min ⑤白细胞和淋巴细胞

（3）①去除相对分子质量较小的杂质

②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内

（4）①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去

②

颜色 直观

4、（1）透明圈

（2）小分子杂质

凝胶色谱

分子大小、吸附性质等差异

电泳

电荷、分子大小等差异

（3）变性、复性和延伸（长）

加热（或高温处理）

5．（1）渗透作用（当外界溶液农度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破）

可以保证溶液pH基本稳定，避免因pH变化影响过氧化氢酶活性

（2）相对分子质量的大小

带电性质、分子大小、形状

（3）不可靠

高温也能使过氧化氢分解