课题3　血红蛋白的提取和分离优质公开课教案

血红蛋白的提取和分离

1．蛋白质提取与分离的依据

分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。

2．凝胶色谱法

（1）材料：凝胶

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（2）步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3．缓冲溶液

（1）概念：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。

（2）作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。

（3）配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。

（4）本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4)，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。

4．电泳法

（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

（3）类型：

琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。

5．实验操作

实验操作的基本步骤：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

（一）样品处理

（1）红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白。

②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。

③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。

④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。

⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。

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（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。

试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：

①无色透明的甲苯层。

②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。

③红色透明液体：血红蛋白溶液层。

④暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。

（4）透析：

①方法：取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12 h。

②目的：去除样品中分子量较小的杂质。

③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

（二）凝胶色谱操作

（1）凝胶色谱柱的制作

制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管。

（2）凝胶色谱柱的装填

①材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。

②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h，使凝胶装填紧密。

（3）样品的加入和洗脱

使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。

考点一

蛋白质提取与分离的方法及原理

1．下列关于蛋白质的纯化方法的叙述，错误的是

A．纯化主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的

B．透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同

C．通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质

D．不同的物质在同一电场中的移动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质

【参考答案】B 2．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是

A．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中

B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快

C．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内

D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远

【答案】A

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考点二

蛋白质提取与分离的实验操作

3．红细胞中含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是

A．血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定”的顺序进行

B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液

C．样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白

D．可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定

【参考答案】B 易错警示

1．红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2．色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

3．凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。

4．色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

4．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

（1）将实验流程补充完整：A为________，B为________。凝胶色谱法是根据____________而达到蛋白质分离的有效方法。

（2）洗涤红细胞的目的是去除_________，洗涤次数过少，无法除去_________；离心速度过高和时间过长会使_______一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是__________。释放血红蛋白的过程中起作用的是______________。

（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是__________。如果红色区带____________，说明色谱柱制作成功。

【答案】（1）血红蛋白的释放

样品的加入和洗脱

相对分子质量的大小

（2）杂蛋白(血浆蛋白)

血浆蛋白

白细胞和淋巴细胞

离心后的上清液中没有黄色

蒸馏水和甲苯

（3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致

均匀一致地移动

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细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，释放血红蛋白的过程中起作用的是蒸馏水和甲苯。（3）磷酸缓冲液（pH为7.0)能够准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀一致地移动，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

1．蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的

A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同蛋白质分离

B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质

C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质

D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质

2．下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是

A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法

B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出

C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系

D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来

3．关于电泳的说法不正确的是

A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在醋酸纤维薄膜上的移动速度取决于它所带净电荷的多少

D．电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存

4．将处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是

A．血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、细胞破碎物沉淀层

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B．甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层

C．脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物沉淀层

D．甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层

5．相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶色谱柱中的行进过程，可表示为图中哪一个

A．

B．

C．D．

6．在蛋白质的提取和分离实验中，下列对样品的处理过程中，正确的是

A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐

B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水

D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质

7．下列关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述，正确的是

A．为了防止血液凝固，应在采血器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠

B．红细胞洗涤使用5倍体积的蒸馏水，直到离心后上清液不呈现黄色为止

C．利用0.9%的NaCl对血红蛋白溶液透析12小时，可以去除小分子杂质

D．在凝胶柱中加入蛋白样品后即可连接缓冲溶液洗脱瓶进行洗脱和收集样品

8．镰刀型细胞贫血症是一种由基因突变引起的遗传病，患者的红细胞是弯曲的镰刀状。这样的红细胞容易破裂，使人患溶血性贫血，严重时会导致死亡。某科学兴趣小组计划从血红蛋白的成分是否变化来开展研究性学习。下列是该小组成员获得纯度很高的血红蛋白的实验过程，不正确的一项是

A．对红细胞进行洗涤，在加入蒸馏水和甲苯使红细胞破裂释放出血红蛋白后，将混合液静置一段时间后分层获得血红蛋白溶液

B．将血红蛋白溶液装入透析袋中透析，可达到粗分离的目的

C．利用凝胶色谱操作对血红蛋白进行纯化

D．使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定，以获得纯度很高的血红蛋白

9．随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质进行研究时，首先要获得纯度较高的蛋白质。下图是某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”：

请回答下列有关问题：

（1）样品处理中红细胞的洗涤要用__________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度的pH为7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是______________。

（2）血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是___________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以__________________________（写出一种方法）。

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（3）血红蛋白的纯化是通过____________法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。

（4）电泳利用了待分离样品中各种分子的_________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。

（5）一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有______种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是_____________________________________________________。

10．红细胞内含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：

（1）血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：________、粗分离、纯化和________。

（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行处理、离心后，收集血红蛋白溶液。以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、____________________、____________________。

（3）收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是________。然后通过________将样品进一步纯化，最后经________进行纯度鉴定。

（4）如图是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入和洗脱示意图。请据图回答下列问题。

①在加样品示意图中，正确的顺序是___________________。

②用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是______________、______________、________________。

③待________________时，才加入缓冲溶液。

④待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一管，连续收集。

1．【答案】A 2．【答案】C 【解析】凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小决定了被分离的物质分子的运输路径，从而实现了物质的分离，C错误。

3．【答案】C 【解析】电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确；由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，B正确；在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电，加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小，C错误；电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存，D正确。

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4．【答案】D 【解析】将处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层，D正确。

5．【答案】B 【解析】相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确。

6．【答案】D 【解析】透析的原理是渗透，其目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。

7．【答案】A

8．【答案】A 【解析】对样品进行处理时，应先通过低速短时间离心的方法对红细胞进行洗涤，再加入蒸馏水和甲苯使红细胞破裂释放出血红蛋白后，将混合液置于离心管中，以2 000 r/min的转速离心10 min后分层获得血红蛋白溶液，A项错误；将血红蛋白溶液装入透析袋中，再将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12 h，可达到粗分离的目的，B项正确；可利用凝胶色谱操作对血红蛋白进行纯化，C项正确；使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定，以获得纯度很高的血红蛋白，D项正确。

9．【答案】（1）生理盐水

渗透原理（当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破）

（2）除去小分子杂质

增加缓冲液的量或及时更换缓冲液

（3）凝胶色谱

（4）带电性质以及分子大小、形状

（5）2

携带者具有一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质

【解析】（1）样品处理中红细胞的洗涤要用生理盐水反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度的pH为7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是渗透原理（当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破）。（2）血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去小分子杂质。（3）血红蛋白的纯化是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。（4）电泳利用了待分离样品中各种分子的带电性质以及分子大小、形状等的差异，而产生不同的迁移速度，实现各种分子的分离。（5）由图可知携带者有2种血红蛋白，因为携带者具有（控制血红蛋白的）一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质。

10．【答案】（1）样品处理

纯度鉴定

（2）血红蛋白的释放

分离血红蛋白溶液

（3）透析

凝胶色谱法

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

（4）①④→①→②→③

②不能破坏凝胶面

贴着管壁加样

使吸管管口沿管壁环绕移动

③样品完全进入凝胶层

③红色的蛋白质

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