课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数主要内容及教案内容

第二节：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(教案) 一.菌种的筛选与选择培养基

1.菌种的筛选：

(1)自然界中目的菌株的筛选：

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选：

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a.可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就令尿素作为培养基中的唯一氮源。

b.可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增值，在数量上占优势。

2.选择培养基：

(1)概念：指允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

(2)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某一化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(3)选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

(4)选择培养基的用途：使混合菌株中的目的菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。

(5)实例：在培养基中以尿素为唯一的氮源，可得到能利用尿素的微生物。(所需培养基的配方如表所示) 培养基组成

含量

提供的营养或作用

KH2PO4

1.4 g Na2HPO4

2.1 g 无机盐

MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖

10.0 g 碳源

尿素

1.0 g 氮源、能源

琼脂

15.0 g 凝固剂

水

容到1 000 mL 氢元素、氧元素

备注：该培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选出能分解尿素的微生物。

(6)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物的目的。

⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

思考1：能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的菌吗？

原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需进一步验证。

二.土壤中分解尿素的细菌的分离

1.实验流程

(1)土壤取样：

①土壤取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

②要求：富含有机质(富含有机质的土壤层中微生物数量大、种类多)，酸碱度接近中性且潮湿(土壤中的微生物大约有70%~80%是细菌，此环境适宜细菌的生长)的土壤。

③取样部位：先铲去表层土3cm左右，再取距地表3~8cm的土壤层，将样品装入事先准备好的信封中。(取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌) (2)制备培养基：以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用。

(3)样品的稀释与涂布平板：

①取样稀释：在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡使土样与水充分混合。将细菌分散，制成101倍土样稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍土壤稀释液。(稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目) ②取样涂布：按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从107~103的顺序涂布平板，不必更换移液管(涂布时稀释倍数的选择：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30~300之间，便于计数；如测定土壤中细菌的数量时，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中放线菌的数量时，一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中真菌的数量时，一般选用102、103、104倍的稀释液进行平板涂布培养)。如下图：

备注：

★图中1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；要有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。

★由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103～107倍的稀释液。

★实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

(4)微生物的培养与观察：

①培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

②计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

③观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。

2.结果分析

(1)是否有杂菌污染：

①对照组培养基上无菌落生长⇒未被杂菌污染

②实验组培养基上菌落数偏高⇒被杂菌污染

③实验组培养基上菌落形态多样，菌落数偏高⇒培养基上可能混入其他氮源

(2)选择培养基是否有筛选作用：

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目⇒选择培养基具有筛选作用

(3)样品的稀释操作：

如果得到了2个或2个以上菌落数在30~300的平板⇒操作成功

(4)重复组的结果：

若选取的是同一种土样，统计结果应该接近。

3.分解尿素的细菌的进一步鉴定

(1)鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基碱性增强，PH升高。因此可以通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生。

即：CO(NH2)2+H2O――→脲酶

CO2＋2NH3

(2)鉴定方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则PH升高，说明该种细菌能分解尿素。

三.微生物数量的测定方法

1.稀释涂布平板法(或活菌计数法或间接计数法) (1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)操作

①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中含菌数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

(3)统计方法：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计多个平板，然后求取平均值。

(4)主要用具：培养基、涂布器

(5)计数依据：培养基上的菌落

(6)优点：计数的是活菌

(7)缺点：操作较复杂，有一定误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数低。

备注：用稀释涂布平板法计数微生物时注意事项

①稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。

②计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。

③间接技术法统计的菌落数往往比实际数目低，原因有：

★当两个或多个细菌连在一起繁殖时，平板上观察到的只是一个菌落。

★统计结果只是活细菌产生的菌落数，而不包括死细菌的数目。

④为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，要设置重复组，取其平均值。

2.显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用血细胞计数板计数。血细胞计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。如图所示：

(3)主要用具：显微镜、血细胞计数板

(4)优点：计数方便、操作简单

(5)缺点：死菌、活菌都计算在内，统计的细菌数往往比实际值偏大。

(5)计算公式：每毫升培养液中细胞个数＝(中方格中的细胞总数中方格中小方格个数)×400×104×稀释倍数。

(6)显微镜直接计数的操作步骤：

①用擦镜纸擦净血细胞计数板，在计数室上面加盖盖玻片。

②摇匀菌液，用滴管吸取菌液在盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入计数室。

③用显微镜观察并将计数室移至视野中央。

④计数：计数5个中格(规格：25×16)的总菌数(若是规格为16×25，则计数4个中格)。按照计算公式求得每毫升菌液中的含菌数。(备注：对于压边的细胞，只计数相邻的两边及其夹角上的细胞即可) 3.滤膜法

补充：

1.设置对照和重复的比较

比较项目

对照

重复

目的

排除非测试因素对实验结果的影响

排除偶然因素对实验结果的影响

实例

空白对照：确定培养基制作是否合格

同一稀释度涂布至少3个平板

2.常用的对照方法：

对照方法

概念

举例

对照组不做任何处理

在验证甲状腺激素功能的实验中，给甲组小蝌蚪饲喂含甲状腺激素空白对照

的饲料(含测试因素——甲状腺激素，为实验组)，给乙组小蝌蚪饲喂等量的不含甲状腺激素的饲料(不含测试因素，为空白对照) 对照组和实验组都在同一研究对象在观察植物细胞的质壁分离和复原实验中，有两次对照：第一次是自身对照

或过程中进行，不另设对照组

在高浓度溶液处理下，质壁分离状态与自然状态形成对比；第二次是在低浓度溶液处理下，复原后状态与质壁分离状态形成对照

相互对照

不单独设置对照组，而是几个实验组在探究酶的最适温度或PH时，设置一系列温度或PH梯度，对比相互对照，比较得出相应的实验结论

各温度或PH下酶的活性高低，即可得出结论

标准对照

不涉计对照实验，而是用标准值或正在亚硝酸盐含量的测定实验中，样品处理液与各种浓度的标准显色常值作为对照

液的对照

指虽给对象施以某种实验处理，但这在验证甲状腺激素功能的实验中，实验设计方案如下：

条件对照

种处理是作为对照组意义的，或者说甲组：饲喂甲状腺激素(实验组) 这种处理不是实验假设所给定的实乙组：不饲喂甲状腺激素(空白对照) 验变量意义的

丙组：饲喂甲状腺激素抑制剂(条件对照) 思考2：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位:株/kg)是不同的，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离, 思考3：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。