课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质教案设计

专题2

微生物的培养与应用

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

导学案

一、自主预习新发现：

1、尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。

本课题“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的目的？

2、如何研究细菌的分离与计数，你的研究思路是什么呢？

㈠.筛选菌株

1、实例：

DNA多聚酶链式反应(PCR技术)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

提出的问题

？

寻找什么环境？

解决问题的思路？

如何寻找耐高温的酶？

解决问题的原理

？

高温（

）其他菌，选出耐高温细菌，从（

）菌种提取耐高温酶。

如果让你筛选某一目的菌株，从中你会得到了什么启示？

2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

3、筛选的方法：利用选择培养基进行分离

㈡.统计菌落的数目：

1、显微镜直接计数法（菌株）：

利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。由于此法计得的是活菌和死菌的总和，又称总菌计数法。

优点：直观、快速，能观察微生物的形态特征且技术简单

缺点：不能区分死菌与活菌；难以计数微小的细菌。

2、

稀释涂布平板法（活体计数法或间接计数法）（计数菌落）

（1）操作方法：稀释涂布平板→统计菌落数

（2）原理：

1个菌落推测1个活菌

（3）统计原则：

思考：为了保证结果准确，一般选择多少数目的菌落数的平板上进行计数？

你如何知道该平板中培养出的菌落在30∼300个？

测细菌数：一般用104、105、106稀释液

测放线菌：一般用103、104、105稀释液

测真菌数：一般用102、103、104稀释液？

你如何使统计菌落的结果更具有准确性？

例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

（4）如何计算每克样品中的菌株数？

每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；

V:所用稀释液的体积；

M:稀释倍数。

练一练：

利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。

1、A同学筛选出150个菌落。

2、B同学筛选出50个菌落。

B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。

请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。

原因：⑴土样不同，

⑵培养基污染或操作失误

(或者是混入了其他的含氮物质)

㈢.设置对照：

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计

实验设计的内容：包括对实验方案、仪器、材料、用具和药品，具体的实验步骤及时间安排等的综合考虑和安排。

实验设计的要求：周密细致。

三、实验流程

四、实验操作

（1）土壤取样：

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样。将样品装入事先准备好的信封中。

注意事项：

无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。后面称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在火焰旁操作。

（2）制备培养基：

制备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。

牛肉膏蛋白胨培养基可作为对照，判断选择培养基是否起到了选择作用。将菌液稀释103～107倍。每个稀释度下需要3个选择培养基，一个牛肉膏蛋白胨培养基。因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。准备（

）支灭菌的试管和（

）支灭菌的移液管。（

）支滴管。

（3）样品稀释：

将10g土样加入盛有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1ml，转移至盛有9ml生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度。

（4）微生物的培养与观察

①按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 ml菌液涂布平板，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，然后将平板置于30℃培养箱内培养2d。

②每隔24h比较一次牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基菌落的数量、形态等，并做好记录。

③挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基的斜面上，观察能否产生颜色反应。

注意事项：

做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。例如，在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

在进行系列稀释的时候，为避免试管相互混淆，可以将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放置在试管架的另一行。这样，试管的位置就能清楚地表示出稀释进行到哪一步。

（5）细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

五、结果分析与评价

1、培养物中是否有杂菌污染

对照的培养皿中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染。反之，则被杂菌污染。

2、选择培养基是否筛选出菌落

牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

3、样品的稀释操作是否成功

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

4、重复组的结果是否一致

如果不同同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。

六、课外延伸

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。

【实践训练】：

1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（

）

A.在液体培养基上进行

B.至少接种一种细菌

C.接种一个细菌

D.及时补充消耗的营养物质

2.使用选择培养基的目的是（

）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别

3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是(

)

A.CO2和N2

B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素

D.葡萄糖和尿素

4.下列说法不正确的是（

）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（

）

A.较多的氮源物质

B.较多的碳源物质

C.青霉素类药物

D.高浓度食盐

6.抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。

⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是

，青霉素是青霉菌的

代谢产物。

⑵在生产和科研中，常选用处于

期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，

和

比较稳定。

⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，

，再计算发酵罐中菌体的总数量。