课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学内容

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教学目标：

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

教学重点：对土样的选取和选择培养基的配制

教学难点：对分解尿素的细菌的计数

教学过程：

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）进行新课

1．基础知识

1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2

，这是因为细菌能合成

脲酶

。

1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

〖思考2〗该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是

稀释涂布平板法

。除此之外，

显微镜直接计数

也是测定微生物数量的常用方法。

【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量[来源:学科网]

1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于

样品稀释液中一个活菌

。通过统计

平板上的菌落数

，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30～300 的平板进行计数。

〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是

（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数

。

〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是

恰当的稀释度

。

〖思考5〗第

二

位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。

1．5统计的菌落数比活菌的实际数目

低

。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是

一个

菌落。因此，统计结果一般用

菌落数

来表示。

1．6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

1．7对照实验是指除了

被测试

的条件外，其他条件都

相同

的实验。满足该条件的称为

对照组，未满足该条件的称为

实验

组。

〖思考6〗请设计本实验的对照实验组：

方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。

方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。

2．实验设计

2．1

实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

2．2 根据图示2－7填写以下实验流程：

配制土壤溶液

2．3 土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

2．4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为10、10、10，放线菌稀释度为10、10、10，真菌稀释度为10、10、10。

2．5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌

345234456系列稀释

涂布平板与培养

菌落计数

一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。

2．6 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。

2．7菌落的特征包括

形状、大小、隆起程度、颜色

等方面。

〖思考8〗土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。

2．9 实验过程

1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

〖思考9〗在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。

3．结果分析与评价

3．1 对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助

生物化学

的方法。

3．2 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的

脲酶

将尿素分解成了

氨

。氨会使培养基的碱性

增强

，PH 升高

。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。

3．3 在以

尿素

为唯一氮源的培养基中加入

酚红

指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变

红

，说明该细菌能够

分解尿素

。

〖思考10〗测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现

黑

色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取

三

个水样。

（三）课堂总结、点评

（四）实例探究

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是

A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌 C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质[来源:学科网ZXXK]土壤中尿素分解菌的分离与计数

分离筛选微生物的原理

人为

条件

有利于目的菌株生长

抑制或阻止其他微生物生长

稀释涂布平板法

显微镜直接计数

微生物计数方法与原理

对照设置与重复设置

实验设计

实验方案

实验操作

结果与分析

解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。

答案：A 例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是

A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期

解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。

答案：C 实践训练

1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）

A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ ）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别

3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素

4.下列说法不正确的是（ ）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（

）

A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐

6. （2017全国I）37． [生物——选修1：生物技术实践]（15分）

某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________（答出两点即可）。

（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择____________________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________。

（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2 HPO4，其作用有________________________（答出两点即可）。

7.(2016四川卷)10.（12分）

图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

（1）图中选择培养基应以_______为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_______色。

（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105 的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为 _____×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较 。

（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_________，突变基因表达的蛋白质含___________个氨基酸。

参考答案

1--5 ACDBC

6.（1）脲酶

分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物

为细胞生物生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

（2）尿素

其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

7.（1）尿素

酚红

红

（2）稀释涂布平板法

1.75 少

（3）UGA 115 ★教学体会

本节课可以从尿素在农业上的重要应用切入，介绍能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。在教学过程中，可以联系生产生活实际，使学生对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。同时通过课题背景的介绍，可以进行STS教育。对于实验中的对照原则，可以指导学生分组讨论，在掌握微生物分离技术的同时巩固实验设计的基本原则。