课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案推荐

选修一 5.3血红蛋白的提取和分离

教学设计

【课题目标】

尝试从血液中提取和分离血红蛋白。

了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤。

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。

【课题重点】凝胶色谱法的原理和方法。

【课题难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【教学过程】

引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

［思考］分离生物大分子的基本思路是什么？

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

［思考］蛋白质的分离和提取的原理是什么？

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。

［思考］高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？

变性、变性、空间结构。

［思考］人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。

【基础知识】

一、凝胶色谱法（分配色谱法）：

1、原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

2、凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

3、分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子。

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

［思考］从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀? 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

二、缓冲溶液

1、作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

2、原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

3、意义：生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。

三、电泳

1、定义：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2、电泳原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分于带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3、电泳过程中影响粒子运动快慢的因素

①粒子带电荷的多少。粒子带电荷越多在电场中运动越快。

②粒子的质量。粒子质量越小在电场中运动越快。

③粒子的形状。呈球形或近球形的粒子比链状粒子运动快。

［思考］阅读教材后，填写下表：

电荷量

决定运动方向

形成库仑力

形成阻力

决定运动速率

√

√

√

√

√

√

电荷性质

√

分子形状

分子大小

4、荷质比：

粒子在电泳时运动的快慢主要取决于电荷与质量比，简称荷质比。荷质比值越大的粒子电泳时运动越快。

5、分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

6、实例：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。

在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

【实验设计】

蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

［思考］是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由血浆和各种血细胞两部分组成。

血细胞中红细胞数量最多，除水分外，细胞的含量最高的化合物是血红蛋白（约90%）。

一、样品处理及粗分离

1、红细胞的洗涤

目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

过程：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色。

提示：样品的处理。切记要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。取血回来后，马上进行离心。

［思考］加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

［思考］你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

2、血红蛋白的释放

方法：加入蒸馏水和甲苯，充分搅拌。

提示：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？

3、分离血红蛋白溶液

由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白。

4、透析

目的：除无机盐离子和小分子有机物质。

原理：半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

过程：取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。

［思考］为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

二、凝胶色谱操作

凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

1、制作色谱柱

［讨论］根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

2、凝胶色谱柱的装填

步骤

①

②

③

④

⑤

准备

计算称量凝胶

配制悬浮液

装填悬浮液

缓冲液洗涤平衡

操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 3、样品加入和洗脱

过程：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质。

提示：洗脱时应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

进行蛋白质纯度鉴定。

【课堂总结】

★教学体会

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法