课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教学设计

专题5

DNA与蛋白质技术

第三节

血红蛋白的提取和分离

北镇市高级中学

李春雨

【课题目标】

（一）知识与能力目标

1、掌握基本概念：①凝胶色谱法

②电泳法

③缓冲溶液。

2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

3、了解大分子蛋白质提取的一般过程：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

（二）学科素养

1、基础知识：从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

2、基本技能：体会从生物组织材料中提取生物大分子的一般流程，培养学生理论联系实际的能力。

3、基本思想：通过科学发现和科学探究，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。

4、情感与态度：理论与方法的关系容易使学生形成科学的理性和客观的认知、以及发展的思维，使学生形成严谨的做事风格和追求成功的不懈态度。

【课题重点与难点】

重点：凝胶色谱法和电泳法的原理和操作。

难点：样品的预处理；色谱柱制作与洗脱。

【教学方法】

启发式教学；多媒体辅助教学。

【教学过程】

（一）引入新课

生物大分子分离纯化在现实生活和科学研究中具有重要的意义。如在生命科学研究中，我们需要从生物材料中分离纯化核酸、蛋白质等，才能对其结构和功能进行研究。在医学检测和医疗实践领域，只有获得相关物质才能展开相关的研究。通过基因工程的学习，我们已经掌握基因工程疫苗和药物的制取方法，而药物成品的获得，同样离不开物质的提取与分离。

1 / 7

（二）展开新课

1．蛋白质分离纯化的原理

根据蛋白质的理化性质的差异：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等，采用不同的方法提取和分离各种蛋白质。

2.大分子分离纯化的一般程序

（1）样品处理：

思考：血液有哪些成分？

思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。

a.红细胞的洗涤: b.血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）

c.分离血红蛋白溶液：

（2）粗分离（粗分级分离）

2 / 7

粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开

盐析(salting out)

概念：指在蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。

原理：蛋白质易溶于水，因为其－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。

亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。

与变性的区别：盐析得到的蛋白质一般不失活，一定条件下又可重新溶解，是物理变化，可复原。向某些蛋白质溶液中加入某些重金属盐，可以使蛋白质性质发生改变而凝聚，进而从溶液中析出，这种作用叫作变性，性质改变，是化学反应，无法复原。

蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步提纯。脱盐常用透析法。

透析

应用：在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。

透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。

透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。

缓冲溶液

3 / 7

概念：在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液。

缓冲溶液的组成举例：

H2CO3 ——

NaHCO3、CH3COOH ——

CH3COONa

NaH2PO4 ——

Na2HPO4、KH2PO4

——

K2HPO4

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

等电点沉淀法

利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。

（3）纯化（细分级分离）

纯化阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来。

层析法包括：

凝胶色谱法——颗粒大小与孔隙直径

离子交换层析——不同PH 条件下，蛋白质所带电荷不同。

吸附层析——吸附剂对各成分的吸附力不同

亲和层析——生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性

凝胶色谱法（分配色谱法）

概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。

大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。

凝胶色谱法的原理—分子筛效应：

4 / 7

当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

凝胶色谱操作

凝胶色谱柱的制作：

凝胶色谱柱的装填

①凝胶的选择：

②凝胶的前处理：

③凝胶色谱柱的装填方法：

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。

样品加入与洗脱

①调节缓冲液面

②滴加透析样品

③样品渗入凝胶床

④洗脱

⑤收集

（4）纯度鉴定

电泳

概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

电泳原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

5 / 7

常见电泳类型：

琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳

【课堂检测】

1、(多选)关于血红蛋白分子的叙述正确的是(

)

A.两个α—肽链，两个β肽链，一个亚铁血红素基团

B.两个α—肽链，两个β肽链，四个亚铁血红素基团

C.亚铁血红素能与CO2结合

D.血红蛋白在人体主要运输能源物质

2.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是(

)

A.层析柱高

B.层析柱的直径

C.缓冲溶液

D.样品的分布

3.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿和＿＿＿＿＿。后三步常用的方法依次是＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

【教学体会】

一．重视对教材资料的深加工和拓展

教材原始材料：凝胶色谱法、缓冲溶液、电泳法。

拓展内容：盐析、透析、等电点沉淀。

二．重视对教学过程的重组和设计

以生物大分子蛋白质的分离纯化为主线，展开四大环节（样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定）一脉相承的教学设计，打破教材先讲原理、再讲过程的思路。

三、本节课的整体设计

环节一：生物大分子分离纯化的意义

由意义出发引发学生对该项技术操作的关注。

环节二：蛋白质分离纯化的原理

由相关原理（分子大小、溶解度、吸附性、亲和力等）介绍相应的技术方法，使学生认识到技术手段的灵活性、多样性。

环节三：蛋白质分离纯化的一般程序（核心）

1.样品处理：提取血红蛋白（洗涤、释放、分离）

6 / 7

2.粗分离：盐析—透析（缓冲溶液、应用、原理、过程）

3.纯化：凝胶色谱法（概念、原理、操作）

4.纯度鉴定：电泳法（概念、原理、方法）

环节四：课堂练习

四、由教材的具体事例上升到一般方法

教材仅以血红蛋白的提取分离为例，使学生直观认识蛋白质分离纯化的过程和方法，有其特殊性和具体性，不能代表大分子提取分离的一般方法。本节课通过整合相关信息，从大分子蛋白质分离纯化的一般方法和过程出发，结合血红蛋白提取分离的实例，使学生更加准确、深度把握大分子蛋白质提取的基本思路和实验操作。对于构建学生知识体系，培养学生的整体意识和大局意识，更有突破性和针对性。

五、不足之处

本节课在学生已有基础上作了进一步的拓展和提升，课堂容量大。在课题设计上，应适当增设学生问答环节，以增强学生的课堂参与度和热情；应适度优化提问环节和组织设计相关内容启发学生的讨论。

7 / 7