复习与测试ppt配用优秀教学设计

高中生物选修一生物技术实践

知识点总结

专题一

传统发酵技术的应用

课题一

果酒和果醋的制作

1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。

2、有氧发酵：醋酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵

乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型单细胞真核生物·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖

孢子生殖

4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O

5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2

6、20℃左右最适宜酵母菌繁殖

酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃

7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧

呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂

9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 2C2H5OH＋4O2→CH3COOH＋6H2O

10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。

11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）

12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，橙色的重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2ｍL，再滴入物质的量浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色

13装置图解读：(1)各部位的作用： ①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管：加水后防止空气中微生物的污染。③出料口：用来取样。

(2)该装置的使用方法---使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。

课题二

腐乳的制作

1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。

2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制

4、毛霉生长的温度条件： 15～18℃

5、来源：来自空气中的毛霉孢子，

直接接种--优良毛霉菌种

6.食盐的作用：析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；同时抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。盐的浓度过高会影响腐乳的口味

7.豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。

8.吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。

9、卤汤中的酒的含量应控制在12%左右。酒精过多，腐乳成熟的时间将会延长；酒精过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。

- 1 - 10、腌制腐乳时，越接近瓶口，杂菌污染的可能性越大，因此要随着豆腐层的加高增加盐的用量，在接近瓶口的表面，盐要铺厚一些，以有效防止杂菌污染。

课题三 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量

1.

制作泡菜所用微生物是乳酸菌

，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，将糖分解为乳酸

。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。

亚酶2C3H6O3+能量 ·分裂方式是二分裂。反应式为：C6H12O6硝酸·含抗生素的牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。

盐2.亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。

发酵时间（d）

·膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但在适宜pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。

·一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好

3.测定亚硝酸盐含量的原理：比色法

在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。

4、材料的选择及用量。

①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。

②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。

5、泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。泡菜坛边沿的水槽还要注满水，以保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。

6、温度:发酵过程温度控制在室温即可,最好在26～36 ℃。温度过高，则易滋生杂菌；温度过低，则发酵时间延长

7、泡菜制作过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化情况分析：

发酵

时期

乳酸菌

乳酸

少

积累增多，pH下降

亚硝酸盐

增加(硝酸盐还原菌作用) 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解) 发酵

少(有氧气，乳酸菌活动受到抑制) 初期

发酵

中期

最多(乳酸抑制其他菌活动) 发酵

减少(乳酸积累，pH下降，抑制其下降至相对稳定(硝酸盐还继续增多，pH继续下降

后期

活动) 原菌被完全抑制) 8、有关泡菜制作的几个问答：(1)用白酒擦试泡菜坛的目的是：消毒

(2)菜坛为什么要密封：因为乳酸菌为厌氧型微生物，密封后造成缺氧环境

若菜坛有裂缝,可能出现的结果：菜坛有裂缝，将导致乳酸菌不能正常生长，而一些杂菌大量繁殖，泡菜会变质

(3)若制作的泡菜“咸而不酸”，可能的原因是：盐过多，抑制了乳酸菌的发酵

(4)加入一些“陈泡菜水”的作用是：提供乳酸菌菌种

专题二

微生物的培养与应用

课题一

微生物的实验室培养

一、培养基

1.培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

2.培养基按照物理性质可分为液体培养基

半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面

生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业生产，固体培养基应用于微生物的分离、鉴定和活菌计数，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。

3.按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。

4.按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。（培养酵母菌和霉菌时，可在培养基加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基加入高浓度的食盐）鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。（如用伊红-美蓝培养基鉴别饮用水是否含有大肠杆菌，若有则菌落呈深紫色，并带有金属光泽）

5.培养基的化学成分包括

水、

碳源

、

氮源

、无机盐、生长因子等。

6.碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、脂质、蛋白质、有机酸、牛肉膏等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

-+7.氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3、NH4（无机氮源），蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨、核酸等有机氮源。只有固氮微生物才能利用N2。同一种物质既可以作碳源又可以作氮源。

8、生长因子：有维生素、氨基酸、碱基等。作用：酶和核酸的组成成分，参与代谢过程中的酶促反应。

9.培养基还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。

10、确定培养基制作是否合格的方法

将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备

二、无菌技术

1.无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

2.消毒与灭菌的区别

·消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如70%酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

·灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

·灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱

；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅

。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯

。

比较项

理化因素的作用强度

消毒

灭菌

较为温和

强烈

消灭微生物的数量

部分生活状态的微生物

全部微生物

芽孢和孢子能否被消灭

不能

能

- 2 - 3.制作牛肉膏蛋白胨固体培养基

（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

（2）倒平板操作的步骤：

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。

③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。

·倒平板操作的讨论

①.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

②.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

③.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

④.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

4.纯化大肠杆菌

（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

5、平板划线法操作步骤：

①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。

③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

·平板划线操作的讨论

①.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

②.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

③.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随

着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

6、涂布平板操作的步骤：

①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。

③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。

④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

·涂布平板操作的讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。

7、菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

课题二

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶

·尿素最初是从人的尿液中发现的

一、筛选菌株 （1）实验室中微生物的筛选的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等；在以石油为唯一碳源的培养基中，可以抑制不能利用石油的微生物生长，而能利用石油的微生物则能得到生长而达到分离的目的；将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物；培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

分离土壤中分解尿素的细菌的培养基条件：以尿素为唯一的氮源

二、统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可- 3 - 在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物

3、显微镜直接计数法：利用血细胞计数板在显微镜下计算一定很容积样品中微生物的数量。

缺点：不能区分死菌和活菌

三、设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰。

四、实验设计

实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

45 6 34 5 测定土壤中细菌的数量，一般选用10 1010 测定放线菌的数量，一般选用10 1010

23 4测定真菌的数量，一般选用10 1010

（3）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天

放线菌25~28℃ 5~7天

霉菌25~28℃ 3~4天

每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征，包括形状、大小、隆起程度、颜色

疑难解答

（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

（2）对分离菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法：

土壤中分解尿素的细菌的分离实验中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，PH升高，因此可以通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生（如加入酚红指示剂，遇碱变红）

课题三

分解纤维素的微生物的分离

一、纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

二、纤维素与纤维素酶

（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。

三、纤维素分解菌的筛选

（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

四、分离分解纤维素的微生物的实验流程：

土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到

鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。

（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤：

倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板

（3）刚果红染色法种类

一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

专题三

植物的组织培养技术 课题一

菊花的组织培养

一、植物组织培养的基本过程

1. 植物组织（外植体）--脱分化—愈伤组织—再分化—胚状体或丛芽—移植—新个体

细胞分化：在植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上都会出现稳定性的差异。

愈伤组织：愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

植物细胞的脱分化：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，也叫去分化。

再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体

二、影响植物组织培养的条件

1、材料的种类：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。 2、适宜的营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖（作用是提供碳源，维持细胞的渗透压）等。 3、植物激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。

4、环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h.

三、

操作流程 1、配制MS固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。

·使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。

·配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。

·在菊花组织培养中，可以不添加植物激素 原因是菊花茎段组织培养比较容易。

·灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

·MS培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？

大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物- 4 - 质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

·微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。

2、外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。

选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

3、接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

4、培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h）

5、移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

6、栽培

·外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。

专题二

月季的花药培养

1、被子植物的花粉发育

被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。

2、

产生花粉植株的两种途径：

①

花药中的花粉—（脱分化）—胚状体—（分化）—丛芽 （诱导）--生根---移栽

②花药中的花粉--（脱分化）—愈伤组织—（再分化）--丛芽

这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。

注意：①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根

3、影响花药培养的因素: 材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素

·亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。

·合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高

·花蕾：选择完全未开放的花蕾

4、实验操作

（1）材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色

（2）材料的消毒:70%酒精浸泡30s---无菌水清洗---0.1%氯化汞浸泡2-4min---无菌水冲洗

（3）接种和培养

注意：①植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种等基本相同。

②

两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这都使花药培养的难度大为增加。

5、菊花组织培养和月季的花药培养的区别：

(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季的花药培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核期的花粉进行培养。

(2)外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。

(3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季的花药培养不需光照；而在后期均需光照

专题四

酶的研究与应用课题

课题1 果胶酶在果汁生产中的作用

1、果胶

植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水。

2、果胶酶

果胶酶能够分解果胶，瓦解植物细胞的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。

3、酶的活性与影响酶活性的因素

(1)酶的活性

指酶催化一定化学反应的能力。酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示。酶反应速度用单位时间内单位体积中反应物的减少量或生成物的增加量来表示。

(2)影响酶活性的因素：

温度

pH

酶的抑制剂

4、工业制作果汁流程：

水果—榨汁---瞬间高温灭菌（90℃）--冷却---酶处理（45℃

1-3h）---离心分离---过滤----浓缩--瞬间高温灭菌（90℃）---包装—制品

课题2 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果

1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。

2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。

课题3 酵母细胞的固定化

1．

固定化酶技术

使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

2．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。

·固定化酶优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。

·固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。

3、实验操作

（1）酵母细胞的活化（用蒸馏水与酵母细胞混合均匀） （2）配制0.05mol/L的CaCl2溶液

（3）配制海藻酸钠溶液(用酒精灯小火间断加热） （4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合

（5）固定化酵母细胞

专题五

ＤＮＡ和蛋白质技术

课题一

ＤＮＡ的粗提取与鉴定

一、实验原理

- 5 - DNA的粗提取：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

1．DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。

此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。

2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

3．DNA的鉴定 在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。

二、实验设计

1、实验材料的选取

不同生物的组织中DNA含量不同。应选取DNA含量高、易得、便于提取的材料。

本实验用鸡血细胞有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

（鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。）

2、破碎细胞，获取含DNA的滤液

（1）若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？

在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

（2）去除滤液中的杂质（最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA）

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（2mol/LNaCl溶解DNA—0.14mol/LNaCl析出DNA--2mol/LNaCl溶解DNA—95%冷酒精析出DNA）。

方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；

方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

（3）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

（4）在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？

滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。

·怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？

具体做法：试管2支，编号甲乙→各加等量2mol/L NaCl 5mL→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化

三、实验操作

制备鸡血细胞液----加柠檬酸钠，静置或离心

↓

破碎细胞，释放DNA----加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌

↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA-----加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌

↓

DNA析出------加蒸馏水至0.14mol/L，过滤取滤渣，再溶解到2mol/L溶液中

↓→除去细胞质中的大部分物质。

DNA初步纯化------- 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物

↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定------ 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．细胞内DNA复制条件

模板（DNA的两条单链）

原料（四种脱氧核苷酸）

酶（解旋酶、DNA聚合酶）引物（RNA） 能量（ATP） 2、RCR复制的条件（体外扩增DNA片段）

模板（模板DNA的两条单链）

原料（四种脱氧核苷酸）

酶（TaqDNA聚合酶）

两种引物（一小段DNA或RNA）

可控制温度

3．细胞内DNA复制过程

①解

旋：在解旋酶作用下DNA两条链打开

②合成子链：以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链。

③形成子代DNA分子：延伸子链，母子链盘绕形成双螺旋结构。

4．体外扩增DNA片段（PCR技术）

变性：在90-95℃时DNA解旋

复性：在50-55℃时引物与DNA单链结合

延伸：在70-72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）

4．PCR的反应过程

课题3 血红蛋白的提取和分离

一、实验原理

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

- 6 - 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（4）作用：

分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

2．缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3．电泳：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

（1）原理：待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）蛋白质的提取和分离的实验操作：样品处理---粗分离---纯化---纯度鉴定

（4）血红蛋白的分离方法：

第一步：样品处理及粗分离

①红细胞的洗涤：重复三次，直至上清液不再呈现黄色，以去除杂蛋白。

②血红蛋白的释放：加入蒸馏水和40%甲苯，用磁力搅拌器搅拌10min。

③分离血红蛋白溶液：得到混合液用离心管离心，可看到试管溶液分成4层，第1层是四苯层，第2层是脂类物质，第3层是血红蛋白水溶液，第4层是红细胞破碎物沉淀，然后过滤，得到下层的红色透明液体。

④透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，放入20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0，12h）

第二步：

凝胶色谱操作

1、制作凝胶色谱柱 2、凝胶色谱柱的装填 3、样品的加入和洗脱

专题6植物有效成分的提取

课题1植物芳香油的提取

(一)、植物芳香油的来源

天然香料的主要来源：动物和植物

植物香料的来源：可以从大约50多个科的植物中提取。如从玫瑰花提取玫瑰油，从樟树树干提取樟油。植物芳香油具有很强的挥发性，组成成分包括：萜类化合物及其衍生物。

（二）、植物芳香油的提取方法：蒸馏、压榨和萃取

常用方法：水蒸气蒸馏法

，原理：利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层。根据蒸馏过程中原料放置的位置，可将此法分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。（柑橘、柠檬芳香油的制备通常使用压榨法。）

不适合用水蒸气蒸馏的原料，可以考虑萃取法，（原理：将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中。只需蒸发出有机溶剂，就可以获得纯净的植物芳香油了。但是，有机溶剂必须事先精制，除去杂质，否则影响芳香油的质量。）

加入

加入无水

（三）玫瑰精油的提取

实验设计

NaCl Na2SO4

过滤

鲜玫瑰花+清水（1：4）

水蒸气蒸馏-

油水混合物

分离油层

除水

玫瑰油

注意：1、玫瑰花选材时间：花开的盛期采收（花朵含油量最高）；2、加入NaCl的目的是增加盐浓度，使油水混合物出现分层；3、加入无水Na2SO4

的作用是吸水

（四）橘皮精油的提取：

主要成分—柠檬烯

，方法---压榨法

操作流程：石灰水浸泡-----漂洗-----压榨----过滤----静置----再次过滤----橘皮油

注意：1、将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡，以提高出油率。2、加入相当于橘皮质量0.25%的NaHCO3和5%的Na2SO4,并调节PH至7—8。3、橘皮在石灰水浸泡时间为10小时以上，确保浸透，防止压榨时滑脱，提

高出油率，不用堵塞筛眼。

课题2 胡萝卜素的提取

（一）基础知识

胡萝卜素是橘黄色的结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。胡萝卜等蔬菜是提取天然β-胡萝卜素的原料。

工业生产上提取天然β-胡萝卜素的方法有：从植物中提取；从大面积养殖的岩藻中获得；利用微生物的发酵生产。

（二）胡萝卜素的提取

实验设计

方法：有机溶剂萃取

实验流程图：胡萝卜

粉碎

干燥

萃取

过滤

浓缩

胡萝卜素

注意事项：

1、水溶性有机溶剂：乙醇和丙酮

；水不溶性有机溶剂：石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳等

萃取胡萝卜的有机溶剂的特点：较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。

2、影响萃取的因素：萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件的影响。一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能充分溶解，萃取效果就好，因此在萃取前要将胡萝卜进行粉碎和干燥。（注意控制温度，温度太高，时间太长会导致胡萝卜素分解）

3、胡萝卜素提取装置的设计：萃取过程应避免明火加热，采用水浴加热。因为有机溶剂是易燃物，直接使用明火易引起燃烧、爆炸。为了防止加热时有机溶剂的挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。

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