课题3　血红蛋白的提取和分离PPT及课堂实录内容

血红蛋白的提取和分离

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1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。

2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。

一、蛋白质的分离技术

1.蛋白质的分离依据

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

2.凝胶色谱法

(1)概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

形态：微小的多孔球体(2)凝胶的特点组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道(3)常用凝胶：葡萄糖或琼脂糖。

(4)分离原理

①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长。

②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。

3.缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。

4.电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

操作流程

1.凝胶色谱法

(1)结合上图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。

直径大小

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

(2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？

答案

相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。

(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？

答案

不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。

2.电泳

(1)从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？

答案

各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。

(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？

答案

否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。

相对分子质量大

较大

垂直向下运动

较短

较快

先流出

相对分子质量小

较小

无规则的扩散运动

较长

较慢

后流出

1.样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除杂蛋白。

②方法：低速短时间离心。

③标准：直至上清液不再呈现黄色。

(2)血红蛋白的释放

红细胞――→到原血液的体积――――――→磁力搅拌器上搅拌――→血红蛋白释放。

蒸馏水40%体积的甲苯(3)分离血红蛋白溶液

2 000 r/min离心10 min①方法：混合液―――――――――――――→分层。

②分层结果(自上而下)：

第1层：无色透明的甲苯层。

第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。

第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。

第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。

③结果处理：将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2.透析——粗分离

(1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

(3)目的：去除样品中相对分子质量较小的杂质。

3.凝胶色谱操作——纯化

(1)凝胶色谱柱的制作

↓

(2)凝胶色谱柱的装填：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入

凝胶色谱柱内

↓

加入加入10 min

冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口(3)样品的加入②加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品

加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面③加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

↓

①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓

(4)洗脱：关闭下端出口，加入磷酸缓冲液，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱

4.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.操作提示

(1)红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。

(3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

(4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

课堂小结

课堂练习

1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质(

) A.路程较长，移动速度较慢

C.路程较短，移动速度较慢

答案

D 解析

凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

2.下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是(

) A.分子带电性质的差异

C.分子的形状

答案

D B.分子的大小

D.分子的变性温度

B.路程较长，移动速度较快

D.路程较短，移动速度较快

解析

电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。

3.下列有关提取和分离血红蛋白的程序，叙述错误的是(

) A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B.通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗分离

C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

答案

B 解析

首先通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，由此可知B的叙述错误。由玻璃纸制成的透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。

4.下图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：

(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是

。

(2)图甲表示

过程，该操作目的是去除样品中

的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以

(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：

。

(3)观察图乙，往色谱柱中加样的正确操作顺序是

(用序号表示)。在进行④操作前，应该等样品

，且要

(填“打开”或“关闭”)下端出口。

(4)图丙表示电泳法分离蛋白质的结果，不同蛋白质得以分离是因为

。

答案

(1)防止红细胞吸水破裂

(2)透析(粗分离)

相对分子质量较小

增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液)

出现紫色；双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白反应，生成紫色物质

(3)②③④①

完全进入凝胶层

关闭

(4)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同

解析

(1)生理盐水与红细胞内液为等渗溶液，故用其洗涤红细胞主要是防止红细胞吸水涨裂。(2)图甲表示血红蛋白粗提取过程，也为透析过程。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质；若要尽快达到理想的透析实验效果，则可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法。透析袋是一种半透膜，双缩脲试剂可以透过这种半透膜，进入袋内与血清蛋白反应，生成紫色物质。

(3)根据教材中往色谱柱中加样的顺序可知，正确的排序为②③④①；图中进行④操作是在样品上部添加缓冲液，在添加缓冲液之前，应该等样品完全进入凝胶层之后，并要关闭下端出口。(4)电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。