复习与测试主要内容及教案内容

《蛋白质分离的原理和方法》教学设计

一、基础知识（下划线部分编制为默写）

1．分离蛋白质的原理

②所带电荷的性质和多少蛋白质特性的差异③溶解度④吸附性质⑤对其他分子的亲和力2．分离蛋白质的方法

(1)凝胶色谱法：

①分子的形状和大小

①概念：也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

形态：微小的多孔球体②凝胶组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道

③原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。

(2)电泳：

①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

②原理：

a．许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

b．在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

c．电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

③方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

二、问题导学

1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？

提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离

的难度。

2．在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？

提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。

3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？

提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

三、重难点分析

1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理

直径大小

运动方式

运动速度

运动路程

洗脱次序

相对分子质量大

大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面

在颗粒间隙垂直向下移动

较快

较短

先从凝胶柱洗脱出来

相对分子质量小

小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部

在颗粒内部无规则扩散运动

较慢

较长

后从凝胶柱洗脱出来

2．电泳的常用方法

(1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①凝胶形成：

②加入SDS的作用：SDS可使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，然后与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

[特别提醒]

(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。

(2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的形状。

1．对血液样品处理后样品发生的变化

(1)正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。

(2)分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。

(3)红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。

2．判断装填的凝胶色谱柱成功与否

(1)判断方法：

①在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填均匀。

②加入大分子的有色物质，观察色带移动情况。

(2)成功的标准及调整：

①判断标准：若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好。

②调整方法：若色谱柱内出现纹路或是气泡，可轻轻敲打柱体以消除气泡，若消除不了则重新装柱。

3．对分离效果的判断

(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。

(2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。

[特别提醒]

(1)凝胶色谱柱的直径不宜过大，直径过大，易造成洗脱液体积增大，样品的稀释浓度过大。

(2)在装填凝胶色谱柱时，要注意不得有气泡存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；在凝胶色谱操作中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生以上现象，凝胶色谱柱必须重新装填。

(3)洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。

四、练习巩固

血红蛋白的提取和分离的原理及操作

[例1]

下图表示血红蛋白的提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有__________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是__________；乙装置中，C溶液的作用是

________________________________________________________________________。

(3)甲装置用于________，目的是____________________________________________。

用乙装置分离蛋白质的方法称为________，是根据______________________分离蛋白质的有效方法。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_______________________________________________时，用试管收集流出液，5 mL一管，连续收集。

(5)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。其中样品处理包括____________、____________、分离血红蛋白溶液。

[思路点拨]

答案：(1)运输

(2)磷酸缓冲液

洗脱血红蛋白

(3)透析(粗分离)

去除样品中相对分子质量较小的杂质

凝胶色谱法

相对分子质量的大小

(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端

(5)红细胞的洗涤

血红蛋白的释放