课题3　血红蛋白的提取和分离优秀课堂实录

血红蛋白的提取和分离

【教学目标】

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

【教学重难点】

课题重点

凝胶色谱法的原理和方法

课题难点

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

【教学工具】

多媒体

【教学过程】

（一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

一、基础知识

（一）蛋白质分离的依据

蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等,可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。

（二）凝胶色谱法 1.概念:也称做分配色谱法;是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

2. 凝胶

大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿

的通道。

3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程

(1)识图析图

分析：

混合物

上柱

洗

脱

大分子流动快

小分子流动慢

收集

大分子

收集

小分子

4.凝胶色谱法的原理（完成填空）

相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较_____,移动速度较______,而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较_______,移动速度较________,从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。

思考：进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？

（三）缓冲溶液

1.作用:在一定范围内,缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。

2.配制:由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。

3.在本课题中使用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。

思考：如何鉴定凝胶色谱法分离得到的蛋白质是目的蛋白？

（四）电泳 1.概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

3．类型：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（PPT介绍相关知识）

二、实验操作

蛋白质提取和分离步骤：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 （一）

血红蛋白

思考：血液有哪些成分？

（二）操作过程

1.样品处理及粗分离

(1)红细胞的洗涤: 目的？

①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。

②洗涤操作：

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

(2)血红蛋白的释放：

①目的：在蒸馏水和甲苯作用下，使红细胞破裂释放血红蛋白。(蒸馏水是为了使红细胞吸水胀破；甲苯是为了溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放与分离。) ②过程：

红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等其他杂质。怎样除去这些杂质呢？

(3)分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。

②目的：经过离心使血红蛋白和其它杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化

③试管中溶液层次：

搅拌好的混合液离心后明显分为4层（如下图），由上至下依次是甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白的水溶液、红细胞破碎物沉淀。

第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）

第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）

第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）

第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）

④分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

思考：如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？

（4）透析

①原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。

②过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l（按1:300的比例）的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

③目的：a一是除去样品中分子量较小的杂质。 b、二是使血红蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。

2.

分离纯化血红蛋白---凝胶色谱操作:（观看操作视频）

(1)凝胶色谱柱的制作

特别提醒：凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果,但直径过大造成洗脱液体积大,样品稀释度大;凝胶色谱柱的高度与分离度有关。

(2)

凝胶色谱柱的装填

注意事项：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；

2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

3、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。

4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

（3）样品加入与洗脱

4.纯度鉴定

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量。

三、操作提示

2.色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。

3.凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。

4.蛋白质的分离:如果红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制作成功。

特别提醒：①红细胞洗涤过程中,洗涤三次后,上清液仍有黄色,可增加洗涤次数,否则无法除去血浆蛋白;离心时转速要低,时间要短,否则白细胞等会一同沉淀,达不到分离效果。

②血红蛋白释放过程中,蒸馏水的作用是使红细胞吸水涨破,甲苯的作用主要是溶解细胞膜。

③为了加快干凝胶的膨胀,可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,逐渐升温至接近沸腾,通常只需1～2 h。这种方法不但节约时间,而且可以除去凝胶中可能带有的微生物,排除胶粒内的空气。

④滴加样品时,吸管管口要贴着管壁环绕移动,防止破坏凝胶面。

四、结果分析与评价

1.血液样品的处理 分层明显 样品处理完成

2.凝胶色谱柱的装填

放一支与凝胶柱垂直的日光灯，直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖-2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整 装填成功。

3.血红蛋白的分离

血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。

小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

【板书设计】

课题3 血红蛋白的提取和分离

一．基础知识

二．实验操作

蛋白质的提取和分离步骤

三．操作提示

四．结果分析与评价