课题3　分解纤维素的微生物的分离名师教学视频（文字实录）

分解纤维素的微生物的分离

[目标导读]

1.结合教材P27“基础知识”，掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。2.阅读教材P28“实验设计”，理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。3.阅读教材P30“课题延伸”，掌握纤维素酶的测定方法。

[重难点击]

1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。

一

纤维素分解菌的筛选的原理

1.纤维素与纤维素酶

(1)纤维素

据图，纤维素是一种由____________首尾相连而成的____________化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。________是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生________________。

(2)纤维素酶

①组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即________酶、________酶和__________酶。

②作用

纤维素―――――→

―――――→葡萄糖

(3)实验验证

纤维素酶

试管

滤纸条

缓冲溶液

(70～80 U/mL) 1 1×6 cm pH＝4.8的0.1 mol/L醋酸—醋酸钠缓冲溶1 mL 两试管固定在

时间足够长，滤纸条件

结果

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶

液10 mL 50 mL锥形瓶中，在摇被_____ pH＝4.8的0.1 mol/L2 1×6 cm 醋酸—醋酸钠缓冲溶液____ mL

床上以140 r/min的转速振荡反应1 h 基本

无变化

①1个酶活力单位是指在温度为________ ℃，其他反应条件最适宜情况下，在________ min内转化________的底物所需要的酶量。

②实验是如何构成对照的？

2.纤维素分解菌的筛选

(1)方法：__________。常用的有两种方法，一种是先_________，再加入_________进行颜色反应；另一种是在____________时就加入刚果红。

(2)原理：刚果红＋纤维素→________复合物――――→纤维素被分解，出现以_________为中心的____________，我们可以通过________________________来筛选纤维素分解菌。

归纳提炼

两种刚果红染色法的比较

项目

内容

方法一

培养基上长出菌落→覆盖质量浓度为过程

1 mg/mL的CR溶液――――→倒去CR溶液→加入NaCl溶液――――→倒掉NaCl溶液→出现透明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

操作简便，不存在菌落混杂问题

①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类制作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

物质，可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性反应；②有些微生物具有降解色素的能力，它们会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分15 min10～15 min纤维素酶方法二

配制CR溶液→灭菌→按照1 mL CR/200 mL培养基比例混匀→倒平板→培养→出现透明圈

缺点

解菌不易区分

1.微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(

) A.C1酶和CX酶

B.C1酶和葡萄糖苷酶

C.CX酶和葡萄糖苷酶

D.C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶

[问题导析]

纤维素是在C1酶和CX酶的作用下被分解为________________，葡萄糖苷酶可以将________________分解为葡萄糖。

2.鉴定纤维素分解菌时，可以使用刚果红对其染色，刚果红染色法有两种常用方法，两种刚果红染色法的结果是(

) A.均会出现透明圈

B.方法一出现，方法二不出现

C.均不会出现透明圈

D.方法一不出现，方法二出现

[问题导析]

刚果红可以跟纤维素结合形成________复合物，加入________________后纤维素被分解，不能形成________复合物，从而出现____________。两种方法都能使纤维素分解，都能形成透明圈。

二

实验设计与操作提示

结合实验原理和教材给出的资料，完成下面的实验方案流程图。

1.实验过程分析

土壤取样：选择富含______的环境，如树林中多年形成的腐殖土

↓



样品中分离到所需要的微生物操作方法：将20克土样，在

条件下加入选择培养可省略

装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将瓶

固定在

上，在一定温度下振荡培养

d，直至培养液变

，也可重复选择

培养目的：增加

，确保能够从

↓



倍稀释液混匀成

↓梯度稀释

混匀成10倍稀释液61 mL培养液＋9 mL蒸馏水

↓

涂布培养：将样品涂布到________________的培养基上

↓

筛选菌株：______染色法，挑选产生______的菌落

↓

纯化培养

2.两种培养基

纤维素分解菌的选择培养基配方1 纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL 鉴别纤维素分解菌的培养基配方2 CMC－Na 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)从功能上来看，培养基配方1为纤维素分解菌的________培养基，该培养基中的唯一碳源是________________，只有能利用它的纤维素分解菌才能生存；培养基配方2为纤维素分解

菌的________培养基。在该培养基中加入____________溶液，当培养基中长出菌落后，由于在该培养基上生长的只能是______________菌，能分泌________________，因此菌落周围会形成____________。

(2)从物理性质上来看，培养基配方1为纤维素分解菌的________培养基，利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度；培养基配方2为纤维素分解菌的________培养基，原因是添加了________成分，需要在培养基上形成我们肉眼可见的________。

(3)若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是__________________。

3.结果分析与评价

(1)培养基的制作是否合格：对照的培养基在培养过程中________菌落生长，则说明培养基制作合格。

(2)选择培养基是否筛选出菌落：如果观察到________________的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

(3)分解的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

4.课题延伸

(1)为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行________________________的实验，纤维素酶的发酵方法有________发酵和________发酵两种。

(2)纤维素酶的测定方法：一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的_________含量进行定量测定。

归纳提炼

纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基的区别

(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)能产生纤维素酶的微生物能以纤维素作为碳源和能源，在培养基中正常生长，其他绝大多数生物不能正常生长。

(3)鉴别培养基中含有琼脂，为固体培养基，刚果红染色法应用的就是此培养基。

3.下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是(

) A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B.选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少

C.经稀释培养后，用刚果红染色

D.对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

[问题导析]

经选择培养后的样品需经___________后，才能涂布到___________的培养基上。

4.鉴别培养基是根据微生物的代谢特点在培养基中加入一些物质配制而成的，这些物质是(

) A.指示剂或化学药品

B.青霉素或琼脂

C.高浓度食盐

D.维生素或指示剂

[问题导析]

鉴别培养基是在培养基中加入________________或________________，使培养后会发生某种变化，从而________不同类型的微生物；培养基中加入青霉素或高浓度食盐的目的是抑制某些微生物的生长；琼脂为凝固剂。

1.在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是(

) A.分解尿素的细菌

C.分解纤维素的细菌

B.硝化细菌

D.乳酸菌

2.不能够与刚果红反应生成红色复合物的是(

) A.纤维二糖

B.纤维素

C.CMC－Na

D.淀粉

3.下列对刚果红染色法的叙述，不正确的是(

) A.可以先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

B.可以在倒平板时就加入刚果红

C.既可以先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，也可以在倒平板时就加入刚果红

D.可以将刚果红与培养基中其他物质一起放入培养基后再灭菌倒平板

4.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列相关问题：

(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是至少由3种组分形成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将______________分解成________。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)染料时，CR可与纤维素形成______色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的_____。

(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落并加以鉴定，某同学设计了甲、乙两种培养基：

培养基甲

培养基乙

注：“＋”表示“有”，“－”表示“无”。

据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离纤维素分解菌，原因是_______；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于鉴定纤维素分解菌，原因是______________。

提醒：完成作业

专题2

训练7

酵母膏

＋

＋

无机盐

＋

＋

淀粉

＋

＋

纤维素粉

＋

－

琼脂

－

＋

CR溶液

＋

＋

水

＋

＋

答案精析

一

知识梳理

1.(1)葡萄糖

高分子

棉花

纤维素酶

(2)①C1

CX

葡萄糖苷

②纤维二糖

(3)11

完全分解

①25

1

1 mmol ②在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸—醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。

2.(1)刚果红染色法

培养微生物

刚果红

倒平板

(2)红色

纤维素分解菌

透明圈

是否产生透明圈

活学活用

1.A

[纤维素酶属于复合酶，至少包含C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。其中C1酶和CX酶使纤维素分解成纤维二糖。]

问题导析

纤维二糖

纤维二糖

2.A

[两种刚果红染色法染色的时间不同，但结果一样，均出现透明圈。]

问题导析

红色

纤维素酶

红色

透明圈

二

知识梳理

1.纤维素

纤维素分解菌的浓度

无菌

摇床

1～2

混浊

10

鉴别纤维素分解菌

刚果红

透明圈

2.(1)选择

纤维素粉

鉴别

刚果红

纤维素分解

纤维素酶

透明圈

(2)液体

固体

琼脂

菌落

(3)将纤维素粉改为葡萄糖

3.(1)没有

(2)产生透明圈

4.(1)发酵产纤维素酶

液体

固体

(2)葡萄糖

活学活用

3.A

[经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。]

问题导析

梯度稀释

鉴别纤维素分解菌

4.A

[在培养基中加入青霉素或高浓度食盐的目的是抑制某些微生物的生长，而加维生素一般是为微生物提供生长因子，起不到选择或鉴别作用，只有在加入某种指示剂或化学药品后，某些微生物会与特定的化学物质发生特定的化学反应，而表现出特有的菌落特征，我们可以根据这些特征去判断属于哪种微生物。]

问题导析

某种试剂

化学药品

区别

课堂小结

刚果红染色

涂布培养

纯化培养

当堂检测

1.C

[分解纤维素的细菌能将纤维素分解，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。]

2.A

[刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不与纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖等发生反应。]

3.D

[刚果红染色法一般有两种：一种是先培养微生物长出菌落后，再加入刚果红进行颜色反应，然后加入一定浓度的NaCl溶液将多余的刚果红带走；一种是配制好培养基灭菌后，倒平板时加入灭菌处理的刚果红，再接种微生物培养直至产生透明圈。]

4.(1)纤维二糖

葡萄糖

(2)红

透明圈

(3)不能

液体培养基不能分离单菌落

不能

培养基中没有纤维素

解析

(1)纤维素酶中的葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)染料时，CR可与纤维素形成红色复合物，并不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，所以用含有CR的培养基进行培养时，会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

(3)根据表格中的相关信息甲不能做为分离纤维素分解菌，因为其中没有琼脂，液体培养基是不能分离单菌落的。培养基乙不能用于分离纤维素分解菌，因为培养基中没有纤维素，无法形成红色复合物，无法筛选。