课题3　血红蛋白的提取和分离教学内容

课题3

血红蛋白的提取和分离

【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【导学诱思】

1．凝胶色谱法

凝胶色谱法也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由

构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质

进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

；而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

2．缓冲溶液

缓冲溶液的作用是

。缓冲溶液通常由

溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是

，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。

3．电泳

电泳是指

。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。

两种常用的电泳方法是

和

，在测定蛋白质分子

量时通常使用

。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

以及

等因素。

4．蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和

。

5．样品处理

血液由

和

组成，其中红细胞最多。红细胞具有

的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质

，其作用是

，血红蛋白有

个肽链组成，包括

，其中每条肽链环绕一个

，磁基团可携带

。血红蛋白因含有

呈现红色。

红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是

，采集的血样要及时采用

分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的

，将下层暗红色的

倒入烧杯，再加入

，缓慢搅拌

，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至

，表明红细胞已洗涤干净。

血红蛋白的释放

在

和

作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的

，第2层为白色薄层固体，是

，第3层是红色透明液体，这是

，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

透析

取1mL的血红蛋白溶液装入

中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的

中，透析12h。透析可以去除样品中

的杂质，或用于更换样品的

。

6．凝胶色谱操作

第一步要制作

，第二步要

，因为

，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有

存在。因为气泡会

，降低分离效果。第三步是

。

【疑难点拨】

1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理

凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，1

样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义

哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

3．电泳的作用及其原理

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

【典例解析】

用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（

D

）

A路程较长，移动速度较慢

B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢

D路程较短，移动速度较快

解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

【课本问题答案和提示】

（一）旁栏思考题

你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？

答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

（二）练习

1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。

缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。

3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

2

5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

[课堂演练] 一．选择题

1．凝胶色谱法是根据（

）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小

B相对分子质量的大小

C带电荷的多少

D溶解度

2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（

）基本不变。

A温度

B

pH

C渗透压

D氧气浓度

3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（

）的电极移动。

A相同

B相反

C相对

D相向

4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（

）与氧气的运输有关。

A血红蛋白

B肌红蛋白

C肌动蛋白

D肌球蛋白

5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（

）的含量最多。

A白细胞

B血小板

C红细胞

D淋巴细胞

6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（

）。

A.

NaCl

B.甲苯

C.蒸馏水

D.柠檬酸钠

7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（

）

A无色透明的甲苯层

B脂溶性物质的沉淀层

C血红蛋白的水溶液

D其他杂质的暗红色沉淀物

二．非选择题

1．电泳利用了待分离样品中各种分子

以及

、

的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

2．你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

专题知识归纳

基础知识：提取DNA的方法

实验材料的选取

实验设计

破碎细胞，获取含DNA的滤液

去除滤液中的杂质

DNA的粗提取

DNA的析出与鉴定

与鉴定

以血液为材料要防止血液凝固

DNA和蛋白质技术

操作提示

加入洗涤剂后，动作要轻缓；加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓

二苯胺试剂要现配现用

结果分析与评价

课题延伸

PCR原理

基础知识

PCR的反应过程

多聚酶链式反

实验操作

应扩增DNA

操作提示

片段

结果分析与评价

课题延伸

凝胶色谱法

血红蛋白的提

基础知识

缓冲溶液

取和分离

电泳

样品处理

实验操作

凝胶色谱操作

SDS—聚丙烯酰凝胶电泳

红细胞的洗涤

实验操作

色谱主填料的处理

凝胶色谱柱的装填

蛋白质的分离

结果分析与评价

课题延伸

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专题知识检测

一、选择题

1．DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（

）

A. 2mol/L

B.0.1mol/L

C. 0.14mol/L

D.0.015mol/L 2．DNA不溶解于（

）

A.NaCl溶液

B.KCl溶液

C.酒精溶液

D.MgCl2溶液

3．鉴定DNA的试剂是（

）

A.斐林试剂

B苏丹Ⅲ染液

C.双缩脲试剂

D.二苯胺试剂

4．在向溶解DNA得NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（

）

A.加快溶解DNA的速度

B.加快溶解杂质的速度

C.减小DNA的溶解度，加快DNA析出

D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出

5．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度及其名称分别是（

）

①0.1g/ml柠檬酸钠溶液②2mol/LNaCl溶液③0.14mol/LNaCl溶液④体积分数为95%的酒精溶液⑤0.015mol/LNaCl溶液⑥0.04mol/LNaCl溶液

A.①③⑤

B.③④

C.②④

D.②③④

6．关于DNA的粗提取与鉴定实验的表达哪项是错误的（

）

A.离心沉淀的血细胞中加水是为了提取DNA B.NaCl溶液的物质的量浓度为2mol/L时，DNA溶解

C.向溶解的DNA烧杯中加蒸馏水是漂洗DNA D.离心后除去血液中的上清液是为了除去杂质

7．

下列关于实验现象的正确描述是（

）

A.向盛有果糖溶液的试管中加入斐林试剂，产生转红色沉淀

B.纸层析法分离叶绿体中的色素时，滤纸条上最宽的色素带呈黄绿色

C.DNA的粗提取中，第二次加入蒸馏水并搅拌，能析出含DNA的黏稠物

D.同一叶片受SO2危害的顺序是先叶柄后叶片

8．

关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述哪一个是正确的（

）

A.随着NaCl溶液浓度增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大

B.随着NaCl溶液浓度的减小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小

C.DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关

D.当NaCl溶液的浓度为0.14M时，DNA的溶解度最低

9．卵原细胞在进行DNA复制时，细胞中不可能出现的是（

）

A.解旋

B.蛋白质合成

C.基因突变

D.基因重组

10．某些药物可以抑制肿瘤细胞DNA的复制，从而达到控制癌症的目的。这些药物作用的

细胞正处在细胞周期的（

）

A.间期

B.前期

C.中期

D.后期

11．哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（

）与氧气的运输有关。

A血红蛋白

B肌红蛋白

C肌动蛋白

D肌球蛋白

12．14. 凝胶色谱法是根据（

）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小

B相对分子质量的大小

C带电荷的多少

D溶解度

二、非选择题

1．粗提取DNA的原理是

，纯化粗提取的DNA的原理是

；在制备鸡血细胞液的过程中，加入的抗凝剂是

，还可使用的抗凝剂是

。

2.在蛋白质的提取和分离实验中，若用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白，需对样品如何处理？

探索·创新

有4瓶失去标签的无色透明液体。已知各装有：大肠杆菌超标的自来水，丙种球蛋白溶液（一种抗体），溶解着DNA分子的2mol/L的NaCl溶液，葡萄糖溶液。

⑴请根据提供的第一步鉴定方法，简要写出用相应物质进行鉴定的其余步骤和结果。

第一步：各取4种液体少许分别倒入4个试管中，缓慢加入蒸馏水并用玻璃棒搅拌，则

。

第二步：

…………………

⑵除上述鉴定DNA的方法外，还可以用哪些方法进行鉴定？

答案：⑴第一步：出现丝状物的溶液，为溶解着DNA分子的2mol/L的NaCl溶液。第二步：向其余3支试管中加入伊红—美兰试剂，呈现深紫色的为大肠杆菌超标的自来水。第三步：将其余2种溶液各取少许倒入2支试管中，加入双缩脲试剂，呈现紫色反应的为丙种球蛋白溶液。最后一瓶为葡萄糖溶液⑵用二苯胺沸水浴变为蓝色；或加入冷却的酒精，搅拌出现丝状物

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