课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案设计

专题5 DNA与蛋白质技术

课题5.3 血红蛋白的提取和分离

一、【课题目标】

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

二、【课题重点】

凝胶色谱法的原理和方法

三、【课题难点】

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、【教学方法】

启发式教学

五、【教学工具】

多媒体课件

六、【教学过程】

（一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

1．基础知识

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：（图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节

酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

1．3凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读教材后，填写下表：

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

决定运动方向

√

形成库仑力

√

形成阻力

√

√

决定运动速率

√

√

√

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

2．实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由 和 两部分组成。

血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。

该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：

色谱柱的装填过程。

步骤

①

②

③

④

⑤

操作要求

计算称量凝胶

配制悬浮液

装填悬浮液

缓冲液洗涤平衡

操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ）

A. 糖类化合物

B. 脂质

C. 蛋白质

D. 核酸

3. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（ ）

A. 血红蛋白是有色蛋白

B. 红细胞无细胞核

C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞DNA含量高

4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）

A. 甲苯

B. 血红蛋白水溶液

C. 脂溶性物质的沉淀层

D. 其他杂质的沉淀

5. 血红蛋白因含有（ ）而呈红色

A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素

6. 下列操作正确的是（ ）

A. 分离红细胞时采用低速长时间离心

B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 7. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（ ）

A. 先加入1ml透析后的样品

B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出

C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功

D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

8. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）

A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

9. 凝胶色谱法操作正确的是（ ）

A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴

B. 将橡皮塞下部切出凹穴

C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面

D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

10. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）

A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

答案：1. D 2.A 3.A 4.D 5.D 6.D 7.C 8.B 9.A 10.D 七、【课余作业】

1、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

2、与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意义？

八、【教学体会】

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让薛生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法

九、【资料袋】

凝胶色谱法分离蛋白质的原理

凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。