课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数PPT及课堂实录内容

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、★课题目标

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

二、★课题重点

对土样的选取和选择培养基的配制

三、★课题难点

对分解尿素的细菌的计数

四、★教学工具

多媒体课件

五、★教学过程

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）进行新课

1．基础知识

1．1 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

2、细菌能利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

3、课题目的

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

4、㈠.筛选菌株

1、实例：PCR技术

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。

启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；

方法：

⑴抑制大多数微生物的生长

⑵促进目的菌株的生长

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结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。

3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：

①从物理性质看此培养基属于哪类？

固体培养基

②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？

碳源：葡萄糖 氮源：尿素

③培养基选择分解尿素的微生物的原理

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

㈡.统计菌落数目：

1、显微镜直接计数：

利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

缺点：

不能区分死菌与活菌；

不适于对运动细菌的计数；

需要相对高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察；

A．直接计数法

这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成。

将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片。然后在显微镜下计数4～5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。

每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400× 1000 ×稀释倍数

B.间接计数法（活菌计数法）

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

C.注意事项

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

（三）设置对照

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主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

A.判断培养基中是否有杂菌污染：

将未接种的培养基同时进行培养。

B.判断选择培养基是否具有筛选作用：

完全培养基（营养成分齐全）接种后培养，观察菌落数目。

（四）实验过程

１、配制土壤溶液

2、系列稀释

3、涂布平板与培养

4、菌落计数

（一）土壤取样

1、天然培养基和合成培养基：

2、土壤取样：

（1）取样的位置：

土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。

（2）取样要求：铲去表层土。

（二）样品稀释

（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液

（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液

（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液

原则：确保平板上的菌落数在30∼300之间。

（三）微生物的培养与观察

1、接种：用适当的稀释液作涂布平板

2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d; 放线菌:25∼28℃, 5∼7d; 霉菌: 25∼28℃, 3∼4d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目

b.以“稳定菌落”为观察对象

（四）鉴定：筛选后必鉴定

鉴别培养基：不影响微生物的生存

酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。

原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→

酚红变红→脲酶阳性

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