课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段第二课时教学设计

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段学案

【自主目标】.PCR的原理和PCR的基本操作。

【自主学习】1．PCR原理: 填写下列表格

参与的组分

解旋酶

DNA母链

DNA聚合酶

引物

在DNA复制中的作用

合成子链的原料

DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为 ，而磷酸基团的末端称为 。DNA聚合酶不能 开始合成DNA，而只能 ，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。

在DNA的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过控制 来实现。在 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来 的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。

PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供： ， ，

， ，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

2．PCR的反应过程: PCR一般要经历 循环，每次循环可以分为 、 和 三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而成的DNA单链会与 结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能 ，使这段固定长度的序列成指数扩增。

3．实验操作: 在实验室中，做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在 中依次加入各组分，，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。

4．操作提示: 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要 。

[疑难点拨] 1.PCR技术简介 :PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。

2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用

①解旋酶：打开DNA双链 ②DNA母链：提供DNA复制的模板 ③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 ④DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸）

3．DNA的合成方向

DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，

端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。

4．PCR的反应过程

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。

5．PCR技术与DNA的复制

PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。（230）

【课堂探究】P63练习 1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1 073 741 824)。

2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述

[课堂展示] 1.一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（ ）A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25 2.（08江苏生物32题）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。

（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。

（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为 。

（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。

②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。