课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课教案

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性。

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯。

二、教学重点：对土样的选取和选择培养基的配制。

三、教学难点：对分解尿素的细菌的计数。

四、教学方法：启发式教学

五、教学工具：多媒体课件

六、教学过程

第一课时

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。通过学习我们知道，培养基的组分包括水、碳源、氮源和无机盐，除了满足对主要营养物质的需求，还应该满足不同微生物对PH、特殊营养物质和氧气的要求。由此可见，我们可以利用含有特殊组分的培养基培养出我们所需要的微生物。这就是我们这节课要学习的内容。

板书：课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

（二）进行新课

课题背景：

尿素是一种重要的氮肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 ，这是因为细菌能合成脲酶

。我们本课题的研究目的：

(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；

(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。

1、研究思路：

1.1 筛选菌株

学生自主阅读P21-22相关内容，思考下列问题：

（1）如何寻找目的菌株？

（2）如何筛选目的菌株？

提示：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，，可以人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。通过配制特定培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

展示本课题使用的培养基配方，思考下列问题：

（1）该配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

（2）该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？

提示：在该配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

1.2 统计菌落数目

教师介绍统计菌落数目理论依据和测定微生物的方法。

统计菌落数目的理论依据：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。

测定微生物数量的方法：

显微镜直接计数法

：先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。

稀释涂布平板法：

采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌

。通过统计平板上的菌落数

，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在

30～300 的平板进行计数。

从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是

（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数

。利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是

恰当的稀释度

。

根据教师介绍的稀释涂布平板法的相关知识，思考问题：

两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？

提示：第二位同学的结果接近真实值。第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。

但是统计的菌落数比活菌的实际数目低

，为什么？因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计三个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后根据下方的公式进行计算。每克样品中的菌株数

= (C÷V)×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数

V：涂布平板时所用的稀释液的体积(ml) M：稀释倍数

1.3 设置对照

学生阅读教材P22-23内容，思考问题：影响A同学实验结果的因素是什么？怎么证明和排除？

提示：一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。排除方案1：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验, 如果结果与A同学一致，则证明A无误; 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。排除方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。即：设置对照，排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称实验组。

第二课时

2、实验设计

实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

根据图示2－7填写以下实验流程：

配制土壤溶液

菌落计数

系列稀释

涂布平板与培养

学生自主阅读教材P23-24的内容，尝试进行实验的设计。

2.1土壤取样

土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.2样品的稀释

分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基。

每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。稀释倍数为103~107。

2.3 微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等方面。

将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否变红。

2.4 细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

3、操作提示

3.1无菌操作：

1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

2）应在火焰旁称取土壤10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

3.2做好标记

4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

3.3 制定计划

5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

第三课时

4、结果分析与评价

4.1培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落。

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

4.2样品的稀释操作是否成功

如果得到两个或两个以上菌落数目在30-300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

4.3重复组的结构是否一致

如果选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，要分析产生差异的原因。

对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。在细菌分解尿素的化学反应中，

细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基

pH 变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素

。

七、板书设计

土壤中尿素分解菌的分离与计数

分离筛选微生物的原理

人为

条件

有利于目的菌株生长

抑制或阻止其他微生物生长

显微镜直接计数

稀释涂布平板法

微生物计数方法与原理

对照设置与重复设置

实验设计

实验方案

实验操作

结果分析评价