课题3　血红蛋白的提取和分离国家优质课一等奖

专题五

课题三

血红蛋白的提取和分离

【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【导学诱思】

思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？

思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？

思考3：

高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？

思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

【教学内容】

一、基础知识：

㈠蛋白质分离的理论基础：

蛋白质各种特性的差异，如 、 、 、

和 等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

㈡凝胶色谱法：

1．概念：也称做__________________，是根据______________________分离蛋白质的有效方法；

2．凝胶：实际是一些微小的____________，由_________________构成，如____________________，小球内部有许多贯穿的___________。

3、原理：

分析P65图5-13，完成下列表格

相对分子质量

直径大小

运动方式

运动速度

运动路径

洗脱次序

洗脱结果

大

小

㈢缓冲溶液：

1.作用：在一定范围内，能抵制外界的 和 对溶液PH的影响，维持PH 。

2.组成：由 溶于水中配制而成。

调节缓冲剂的 就可制得不同PH范围内使用的缓冲液。

1

3.缓冲液正确配制和准确测定的意义：

㈣电泳：

1.概念：指__________________在电场的作用下发生__________的过程；

2.原理：（图5-15）

许多重要的生物大分子，如 、 等都具有可解离的基团，在一定的 下，这些基团会带上 ，在 作用下，这些带电分子会向着 的电极移动。

3.电泳的结果：

电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异，以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 。

4.常用的电泳方法：

________________________和_________________________。测定蛋白质分子量时通常使用_______________________。

二、实验操作：

蛋白质的提取和分离的步骤：

、 、 、 。

㈠样品处理：

1.红细胞的洗涤：

①目的：去除

。

②方法：____________离心，如500 r·min1离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的____________，将下层____________的红细胞液体倒入____________，再加入____________的生理盐水，缓慢搅拌____________，低速短时间离心，如此重复洗涤____________，直至上清液中没有____________，表明红细胞已洗涤干净。

讨论：

提取DNA通常用鸡的红细胞，而提取血红蛋白通常用人的红细胞，为什么？

2.血红蛋白的释放：

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加____________到原血液的体积，再加40％的____________，置于____________上充分搅拌10 min。

3.分离血红蛋白溶液：

⑴方法：将搅拌好的混合液转移至 中，以 的速度离心 分钟。

2

⑵目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。

⑶结果：溶液分为四层：第1层（最上层）： 第2层（中上层）： 第3层（中下层）： 第4层（最下层）： 将试管中的液体用滤纸过滤，除去 ，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 。

㈡粗分离——透析

1.原理：

2.过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入300ml的物质的量浓度为20mmol/L的 中（PH为 ），透析 h。

3.目的：① ② ㈢纯化——凝胶色谱操作：

1.凝胶色谱的制作：

①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平：

②柱底部的制作：

③柱顶部的制作：

④将上述三部分按相应位置组成一个整体；

⑤安装其它附属结构。

注意：底塞中插入的玻璃管的上部不能超出橡皮塞的凹穴底部，否则难以铺实尼龙网还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。

2.凝胶色谱柱的装填：

⑴过程：（填充材料：交联葡聚糖凝胶）

计算：

凝胶溶胀：

固定：

装填：

洗涤平衡：

⑵注意：

a.装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。

b.色谱柱中不能有气泡存在，一旦发现气泡，必须重装。

⑶思考讨论：凝胶的装填为什么要紧密均匀？

3.样品的加入和洗脱：

⑴过程：

3

调整缓冲液面：

滴加透析样品：

样品渗入凝胶床：

再调整缓冲液面：

洗脱：

收集：

⑵注意：

滴加样品时要小心，吸管管口应贴着色谱柱管壁并沿管壁移动加样，不要破坏凝胶面。

㈣纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

三、操作提示：

1.红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。洗涤次数过少，无法除去

；离心速度过高和时间过长会使 ，达不到分离的效果。

2.色谱柱填料的处理：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在 中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1-2h，这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。

3.凝胶色谱柱的装填：

①在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低 。在装填凝胶柱时，不得 。

②气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低分离效果。

③在凝胶色谱操作过程中，不能发生 ，露出 的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

4.蛋白质的分离：在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的

。如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。

四、结果分析与评价：

㈠是否完成了对血液样品的处理？

1.血液样品离心后是否分层？

2.若离心速度过高和时间过长，会出现什么结果？

3.刚分离后的血红蛋白呈什么颜色？

㈡如何判断凝胶柱装填是否成功？

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㈢蛋白质的分离过程中如何根据红色区带的移动情况来判断分离效果？

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