课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件课堂实录

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。

尿素最初是从人的尿液中发现的。

筛选菌株

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数

2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC（在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义）. 3.本法仅限于形成菌落的微生物

设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

实验设计

实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用103 104 105

测定真菌的数量，一般选用102 103 104

（3）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃

1~2天

放线菌25~28℃

5~7天

霉菌25~28℃

3~4天

每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色

疑难解答

（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

说明：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的知识一个菌落.

因此，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低;

所以，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。

另外：显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

（2）设置对照 什么是对照实验？

对照实验是指除了测试的条件外，其他条件都相同的实验；

作用是比照实验组，排除任何其他可能因素的干扰，说明确实是所测试条件引起相应的结果；

设置对照的主要目的是排除实验组中费测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

4.（分离土壤中分解尿素的细菌的）实验设计

⑴．实验设计包括哪些内容？

包括对实验方案、所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

⑵．分离土壤中分解尿素的细菌的实验操作步骤（有哪些？）

①．土壤取样

②．样品的稀释

③．微生物的培养与观察

旁栏思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

提示：因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的；

而稀释的原则是保证平板上的菌落数在30到300之间。

例如，在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。

因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

⑶．培养微生物的条件是都相同？不同种类的微生物，需要不同的培养温度和培养时间。

例如：细菌一般在30～37℃下培养1～2d；

放线菌一般在25～28℃下培养5～7d；

霉菌一般在25～28℃下培养3～4d；

一般来说，在相同的培养基、相同的温度和相同培养时间里，同种微生物能表现出菌落的形状、大小、隆起程度和眼色等方面稳定的菌落特征。

小常识：研究未知的微生物，一定要注意进行规范的无菌操作，以防止被致病的微生物感染。

试验后，一定要洗手。

⑷．操作提示（操作过程中应特别注意）

①．无菌操作

A．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌；

B．应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入烧瓶中，塞好棉塞；

C．在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行；

②．做好标记在使用数量较多的平板和试管时，为避免混淆，应在使用前注明培养及种类、培养日期及稀释度。

③．规划时间对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以提高工作效率，保证操作时有条不紊。

小资料：细菌的数目还可以通过过滤膜法测定；

例如，测定饮用水中大肠杆菌的数目。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。