课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀教案案例

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课题3

分解纤维素的微生物的分离

1．了解纤维素与纤维素酶。

2．理解纤维素分解菌的筛选原理。(重点) 3．简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。

纤

维

素

与

纤

维

素

酶

及

纤

维

素

分

解

菌

的

筛

选

1．纤维素

(1)元素组成：C、H、O三种元素。

(2)组成单体：葡萄糖。

(3)种类：除天然纤维素外，还有水溶性的羧甲基纤维素钠、不溶于水的微晶纤维素等。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。

(2)作用

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶纤维素―――――――→纤维二糖―――――――→葡萄糖

3．纤维素分解菌的筛选

(1)方法

刚果红方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

染色法方法二：在倒平板时就加入刚果红(2)原理：

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刚果红形成红色＋――→复合物

纤维素培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此筛选

[合作探讨]

探讨1：草食性动物是怎样消化食物中的纤维素的？

提示：反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。微生物能够产生纤维素酶，最终将纤维素分解成葡萄糖。

探讨2：培养基中出现透明圈一定是纤维素分解菌的作用吗？

提示：不一定。刚果红与多糖类化合物产生红色复合物，若多糖为淀粉，产生淀粉酶的微生物也可使培养基产生透明圈。

[思维升华]

1．实验原理

即可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2．两种刚果红(CR)染色法的比较

方法一

培养基经涂布培养长出菌落→覆盖质量浓度为1 mg/mL10～15 min后的CR溶液―――――→倒去过程

CR溶液→加入物质的量浓度为1 mol/L的NaCl溶液15 min后――→倒掉NaCl溶液→出现透明圈

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方法二

配制质量浓度为10 mg/mL的CR溶液→灭菌→按照每200 mL培养基加入1 mL的比例加入CR溶液→混匀→倒平板→接种后培养→出现透明圈

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区别

优点

先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

倒平板时就加入刚果红

操作简便，不存在菌落混杂问题

①由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应

②有些微生物具有降解色素的能力，长时间培养会降解刚果红，从而形成明显的透明圈，这些微生物与纤维素分解菌不易区分

缺点

操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂

1．下列关于纤维素的叙述中，不正确的是(

) A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物

B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能够产生纤维素酶

C．植物的根、茎、叶等器官中都含有大量的纤维素

D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而作为生物体的能量来源

【解析】

自然界中许多生物都不能分解纤维素。故选D。

【答案】

D 2．下列关于纤维素酶的叙述中不正确的(

) A．纤维素酶可将纤维素先分解为纤维二糖，再分解为葡萄糖

B．纤维素酶含有C、H、O、N等元素

C．用纤维素酶处理玉米根尖成熟区细胞后，将细胞放入0.3 g/mL的蔗糖溶液中出现质壁分离现象

D．纤维素酶是一种复合酶

【解析】

纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素高考资源网版权所有，侵权必究！

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酶属于蛋白质，含C、H、O、N等元素。植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素，用纤维素酶处理后。细胞壁被去除，细胞不能再发生质壁分离现象。故选C。

【答案】

C 3．纤维素分解菌的筛选原理是(

) A．刚果红可以与纤维素形成红色复合物

B．刚果红可以与纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物

C．刚果红可以与纤维素酶形成红色复合物

D．刚果红可以与纤维素分解菌结合形成红色复合物

【解析】

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和纤维素水解后产生的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，刚果红也不与纤维素酶或者与纤维素分解菌结合形成红色复合物。故正确答案为A。

【答案】

A

实

验

设

计

和

课

题

延

伸

1．实验设计

土壤取样：选择纤维素丰富的环境

选择培养：通过选择培养来增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从

样品中分离到所需要的菌株

梯度稀释：目的是使菌体分离

涂布培养：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

挑选菌株：挑选产生透明圈的菌落

2．课题延伸

(1)为确定透明圈内的菌落是否是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

(2)纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

[合作探讨]

探讨1：为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

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提示：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种环境中获得目的微生物的概率要高于普通环境。

探讨2：在纤维素分解菌的筛选过程中涉及到的生物技术有哪些？

提示：主要用到培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用和土壤取样等。

[思维升华]

1．对纤维素分解菌筛选流程的说明

(1)纤维素分解菌的选择培养基中无凝固剂，为液体培养基。利用液体选择培养基可以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)为确定得到的细菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产生纤维素酶的实验。因为形成透明圈的菌落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌种。

(3)流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。

(4)本实验流程与课题2的流程有一定的区别。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。

2．纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的比较

(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)纤维素分解菌的鉴别培养基为固体培养基，因为需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)在上述选择培养基中能以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；而在上述鉴别培养基中，绝大多数微生物都可以正常生长。

1．从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计正确的是(

) A．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→发酵培养

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B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落

C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落

D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落

【解析】

正确的实验设计一般是：土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将样品涂布到有特定鉴别作用的培养基上→挑选菌落。

【答案】

B 2．人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：

【导学号：05520017】

(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是______(填序号)。

①酒精灯

②培养皿

③显微镜

④无菌水

(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是_______ _______________________________________________________________。

(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是______。

(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落(见下图)。图中降解圈大小与纤维素酶的______有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是__________(填图中序号)。

(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株______更适合用于人工瘤胃发酵，理由是______。

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【解析】

(1)在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。

(2)在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆积在培养基表面影响分离效果。

(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。

(4)因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。

(5)考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下观察在不同温度和pH条件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。

【答案】

(1)③

(2)如滴加过多，培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果

(3)避免培养基污染棉塞

(4)量与活性

①

(5)J4

发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高

1．配制的某培养基的成分是纤维素粉、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、高考资源网版权所有，侵权必究！

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MgSO4·7H2O、KCl、酵母膏、水解酪素，该培养基能使下面哪种微生物大量繁殖(

) A．酵母菌

C．各种细菌

B．自生固氮菌

D．纤维素分解菌

【解析】

该培养基的有机营养成分里面含碳的营养物质是纤维素，只有能分解利用纤维素的纤维素分解菌才能在该培养基上大量繁殖。故选D。

【答案】

D 2．下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是(

) A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

【解析】

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。

【答案】

C 3．通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行(

) A．发酵产纤维素酶的实验

B．提取纤维二糖的实验

C．浓缩纤维素分解菌的实验

D．提取葡萄糖的实验

【解析】

对纤维素分解菌的鉴定，常用的方法是对分离的菌种进行发酵产纤维素酶的实验。

【答案】

A 4．植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：

(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的高考资源网版权所有，侵权必究！

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复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。

(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：

培养

基甲

培养

基乙

酵母膏

＋

无机盐

＋

淀粉

＋

纤维素粉

＋

琼脂

－

CR溶液

＋

水

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

＋

注：“＋”表示有，“－”表示无。

据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________；

培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________________。

【解析】

(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来

筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。

【答案】

(1)纤维二糖

葡萄糖

(2)红

透明圈

(3)不能

液体培养基不能用于分离单菌落

不能

培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌

课堂小结：

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网络构建

核心回扣

1.纤维素酶是复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶等组分。

2.纤维素酶的作用是：纤维素C1酶和CX酶葡萄糖苷酶――――→纤维二糖――――→葡萄糖。

3.刚果红可与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

4.分离分解纤维素的微生物的实验流程：

土壤

选择―→―→梯度稀取样培养将样品涂布到鉴别纤维释―→―→素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落

5.分离后，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。

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