课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计模板

一、蛋白质分离技术

（一）原理分析

设计如下例题：

例题1、根据蛋白质各种特性的差异，如

1、分子的形状和大小

2、所带电荷的性质和多少

3、溶解度

4、吸附性质

5、对其他分子的亲和力等等

。

可以用来分离不同种类的蛋白质。

如:展示图片

（二）方法的了解

请学生回答（凝胶色谱法、电泳法）

二、凝胶色谱法的理解

（一）过程

a.

的蛋白质由于

作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；

___________________

的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。

例1．下图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质，在凝胶中的行进过程的是(

)

例2、填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。

小结

p64

较小

垂直向下运动

较快

较大

较长

(1)概念：也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。

(2)凝胶的特点

(3)常用凝胶：

或琼脂糖。

(4)分离原理

①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

，通过凝胶的时间

。

②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶_____移动，路

程

，移动速度

，通过凝胶的时间

（二）凝胶色谱操作p67、p68

（1）凝胶色谱柱的制作：

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。

②底塞的制作：

打孔→挖出凹穴→

安装0.5ml移液管头部（5cm长）→

覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。

③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

（2）凝胶色谱柱的装填

①凝胶的选择：

A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。

B、表示意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度

及分离范围。

75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨

胀时吸水7.5克。

②凝胶的前处理：

配置凝胶悬浮液：

计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中

充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③凝胶色谱柱的装填方法：

A、固定：将色谱柱装置垂直固定在支架上。

B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱

内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀

注意：

装填凝胶柱时不得有气泡存在：

因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

④洗涤平衡：

连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。

注意：

液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果

播放动画1 （3）样品加入和洗脱p68-69 例题分析

例3、选出正确的顺序（

）

A

B

C

D 分析：

①调节缓冲液面：

打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，

注意：

1、不要触及并破坏凝胶面。

2、贴壁加样

3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样

③样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

④洗脱：加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。

（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

播放动画2 三、缓冲溶液

p65

讲义1.3

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制

对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_____

就可以制得

的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持_____

与体内环境中的pH基本一致。

四、电泳

p65

填空

1、概念：在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

2、原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这

决定

运动方向

形成

库仑力

形成

阻力

决定

运动速率

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3、影响蛋白质分子运动速度的因素分析

4.类型及用途

（提问）

琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。

练习：分子量测定：化学物质SDS能使蛋白质变性，解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入一定量的SDS，电泳迁移率完全取决于肽链的分子大小。下图为某实验中用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法可靠吗？理由是