课题3　血红蛋白的提取和分离教学实录

科目

第13课时

学习目标

学习重点

学习难点

生物

年级

高二

备课人

高二生物组

血红蛋白的提取与分离

1、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理， 2、用流程图表示并体验血红蛋白的提取与分离过程

1、说出凝胶色谱法分离生物大分子的基本原理和方法 2、体验血红蛋白的提取和分离过程

理解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

【任务驱动】艾弗里在做肺炎双球菌的体外转化实验中是如何分离纯化S型菌的DNA、蛋白质和其他物质的？

【自主学习】

1．提取和分离蛋白质的原理：利用蛋白质的各种理化特性如 、 吸附性和亲和力等）的差异，将不同的蛋白质分离开来。

2．凝胶色谱法是根据 分离蛋白质的一种有效方法。

3．凝胶大多数是由多糖化合物（如 、 等）构成的微小多孔球体。当相对分子量不同的蛋白质分子通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程较 ，移动速度较 ；相反，相对分子量较大的蛋白质在凝胶颗粒外部移动，路程较 ，移动速度较 。

4．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，而保持pH 。缓冲溶液通常由1～2种 溶解于水配制而成。调节缓冲剂的使用 可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。

5、电泳是指带电粒子在 的作用下发生迁移的过程。在一定的pH下，许多生物大分子上可解离的基团就会带上 电。在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子 的差异，决定带电分子迁移快慢的是带电分子 的不同。

6．常用的电泳方法有 电泳和 电泳。为了消除样品分子原有净电量对迁移速率的影响，可以在凝胶中加入 ，使样品分子的迁移速率完全取决于分子的 。

7．蛋白质的提取和分离的一般分为四步：样品处理、 、 和纯度鉴定。

8．凝胶色谱柱的制作。

2．（学会）凝胶色谱柱的装填：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶（G－75），其中G表示交联程度、膨胀程度和分离范围；75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

将凝胶用 充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内，使凝胶装填均匀并不能有 存在。然后用 充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。

3．（记忆）样品的加入和洗脱：用吸管沿 将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近 时，用试管连续收集，每试管收集5mL流出液。

三、操作提示

【活动6】阅读教材P69“操作提示”部分，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）洗涤红细胞时，离心速度过高或离心时间过长，会使白细胞等一同沉淀。

2．（记忆）为了加快凝胶膨胀，可以将加入 的湿凝胶用沸水浴加热，不仅节约时间，还能除去凝胶中的 和空气。

3．（记忆）凝胶色谱柱中不能存在气泡，原因是气泡会 。

〖课堂检测〗

【思考1】凝胶色谱柱与固定化酶的反应柱有何区别？

【思考2】维持人体血液pH稳态的缓冲对有 ，

其作用是 。

2．（学会）红细胞的洗涤：洗涤的目的是除去血浆中的 ，以利于后续步骤的分离纯化。为防止血液凝固，应预先加入 ；所用洗涤液是五倍于红细胞液的 ；洗涤中用玻璃棒缓慢搅拌，用离心机 离心；洗涤干净的标准是上清液 色。

3．（学会）血红蛋白的释放：释放的目的是将血红蛋白从 细胞中释放出来。

在红细胞液中加入等体积的蒸馏水和40％体积的 ，置于

搅拌器上充分搅拌。

4．（学会）分离血红蛋白溶液：目的是从红细胞破碎混合液中分离出血红蛋白溶液。

将红细胞破碎混合液进行高速离心处理后，离心管中从上到下依次是：无色透明的 层、白色固体的 沉淀层、红色透明的 溶液层和暗红色的 沉淀层。用滤纸过滤以除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置后分离出血红蛋白溶液。

5．（学会）透析：透析的目的是除去血红蛋白溶液中的 和 物质。

将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入 缓冲液中透析12h.。

【思考3】样品处理分离与纯化的目的有何不同？