课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教案

血红蛋白的提取和分离

教材内容

要点1

分离不同蛋白质的的原理

根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质。如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等。

要点2

凝胶色谱柱

（1）定义

凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

（2）凝胶

所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。

（3）分离原理

在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分于质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

要点3 缓冲溶液

（1）缓冲溶液的缓冲作用

在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

（2）缓冲溶液的意义

生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。

要点4

电泳

（1）定义

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

（2）电泳原理

许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分于带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

（3）电泳过程中影响粒子运动快慢的因素

①粒子带电荷的多少。粒子带电荷越多在电场中运动越快。

②粒子的质量。粒子质量越小在电场中运动越快。

③粒子的形状。呈球形或近球形的粒子比链状粒子运动快。

要点5

实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

（1）样品处理

①红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

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洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

②血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。

蒸馏水和甲苯作用：使红细胞破裂释放出血红蛋白。

③分离血红蛋白溶液

④透析

取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。

(2)凝胶色谱操作

①凝胶色谱柱的制作

②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用

③样品的加入和洗脱

④注意事项

在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

要点6

疑难解答

从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀?

凝胶色谱的分离时，相对分子质量较大的蛋白质分于只能从颗粒之间向下移动，通过的路程较短，移动速度较快，相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢．因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

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