课题3　分解纤维素的微生物的分离第二课时教学实录

第7课时

分解纤维素的微生物的分离

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1.结合教材P27“基础知识”，掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。2.阅读教材P28“实验设计”，理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。3.阅读教材P30“课题延伸”，掌握纤维素酶的测定方法。

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1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。

一、纤维素分解菌的筛选

1．纤维素与纤维素酶

(1)纤维素：下图所示为纤维素的结构式。

①基本组成单位：______。

②分布：主要分布在植物______等器官的细胞壁。

(2)纤维素酶

①组成：是一种复合酶，至少包括三种酶，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

②作用：纤维素―――――――→纤维二糖―――――――→葡萄糖

2．纤维素分解菌的筛选

(1)方法：____________。

①方法一：先培养____________，再加入____________进行颜色反应。

②方法二：在________时就加入刚果红。

(2)原理

纤维素＋刚果红→红色复合物

↓纤维素酶

纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物

↓

以____________为中心的透明圈

1．纤维素酶

(1)纤维素酶是如何将纤维素分解的？

(2)如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？

2．纤维素分解菌的获得

(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

(2)为什么将滤纸埋在土壤中可以提取到目的菌？

3．分析教材P29“纤维素分解菌的选择培养基配方”，回答下列问题：

(1)此配方是液体培养基还是固体培养基？为什么选择此类培养基？

(2)这个选择培养基对微生物是否具有选择作用？怎样设计对照实验证明你的观点？

归纳总结

纤维素分解菌的富集培养

1培养基特点：纤维素分解菌的选择培养用的是富含纤维素的培养基，而不是以纤维素为唯一碳源的培养基。

2培养结果：由于培养基中加入了酵母膏和水解酪素等，因此培养基上除得到大量的纤维素分解菌外，也有其他微生物的存在。

3进一步筛选：需根据微生物的菌落特点继续进行鉴别培养以筛选到纤维素分解菌。

4选择培养的实质：纤维素分解菌的选择培养实质是富集培养，以便得到大量的目的微生物。

1．下列关于纤维素酶的叙述中，错误的是(

) A．纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖

B．纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分

C．纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质

D．分解纤维素的细菌、真菌和放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的

一题多变

(1)上题中分解纤维素的细菌能否在不含纤维素但富含其他有机物的环境中生存？为什么？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(2)题中纤维素酶也在微生物细胞内分解纤维素吗？为什么？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

2．分析下表培养基的配方，请回答下面的问题。

纤维素分解菌的选择培养基：

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。

(1)此培养基配方中为微生物提供碳源的主要是___________、氮源是____________。

(2)此配方为__________培养基(根据物理状态)配方。

(3)此培养基选择出的微生物主要是__________________________________________。

问题导析

(1)该培养基中________是主要的碳源，所以可以用于筛选___________。

含量

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g

(2)由于该培养基中没有加入______，所以为液体培养基。液体培养基中微生物与营养成分的接触更充分，可以提高微生物的代谢效率。

一题多变

(1)从土壤中分离纤维素分解菌时，哪种情况下可以省略选择培养？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(2)本题中的培养基配方中的酵母膏可以为微生物提供什么成分？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)该培养基中纤维素是否为唯一的碳源？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

二、尝试从土壤中分离出分解纤维素的微生物

1．实验流程

土壤取样：选择富含________的环境

↓

选择培养：用富含________的选择培养基扩大培养

↓

__________：依次稀释101～106倍

↓

涂布平板：将样品涂布到______纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生__________的菌落

2．实验操作注意事项

(1)土壤取样时要选择富含______的环境。

(2)选择培养的方法：用富含______的选择培养基。

目的：增加____________的浓度。

(3)梯度稀释的目的：能获得单个菌落。

(4)涂布平板时要选择______纤维素分解菌的培养基。

(5)挑选产生______的菌落。

3．菌种的进一步鉴定

(1)鉴定原理：为确定透明圈内的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产______的实验。

(2)发酵方法：有______发酵和______发酵两种。

(3)纤维素酶的测定方法：一般是对纤维素酶分解______等纤维素后所产生的__________进行定量的测定。

1．鉴别纤维素分解菌的培养基

(1)鉴别纤维素分解菌时需在培养基中添加什么物质？

(2)鉴别培养基和选择培养基在目的和物理性质方面的区别是什么？

2．鉴别方法——刚果红染色法

从显色结果上看，两种刚果红染色法中哪种染色法更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌？

3．透明圈的形成

(1)对分离的纤维素分解菌作进一步的鉴定的原因是什么？

(2)简要概述筛选纤维素分解菌时透明圈是如何形成的。

(3)向含有分解尿素的细菌的培养基中加入酚红指示剂，会出现类似的圈吗？

归纳总结

两种刚果红染色法的比较

比较项目

方法一

先培养微生物，再加入刚果红

显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂

方法二

在倒平板时加入刚果红

操作简单，不存在菌落混杂

有些微生物会降解刚果红，形成透明圈，与纤维素分解菌相混

优点

缺点

3．下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是(

) A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

4．研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物，请就如何从土壤中获得纤维素分解菌回答以下问题：

(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和______酶。

(2)若获得纯净的菌株，常采用平板划线法进行接种，此过程所用的接种工具是________，操作时采用________灭菌的方法。

(3)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与__________和__________发生这种反应。常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在____________时就加入刚果红。

(4)如果观察到产生__________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行______________的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。

易错易混

关于纤维素分解菌筛选的三个易错警示

(1)纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。

(2)在纤维素分解菌的选择培养基中生长的不只有纤维素分解菌。因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。

(3)出现透明圈的菌落也不一定是纤维素分解菌。

1．加工橘子罐头，采用酸碱处理脱去中果皮(橘络)，会产生严重污染。目前使用酶解法去除橘络，可减少污染。下列生长在特定环境中的4类微生物，不能产生所用酶的是(

) A．生长在麦麸上的黑曲霉

B．生长在酸奶中的乳酸菌

C．生长在棉籽壳上的平菇

D．生长在木屑上的木霉

2．当纤维素被纤维素酶分解后，会在培养基中出现一些透明圈，这些透明圈是(

) A．刚果红与纤维素形成的复合物

B．纤维素分解后的葡萄糖

C．由纤维素酶聚集在一起形成的

D．以纤维素分解菌为中心形成的

3．在分解纤维素的微生物的分离实验中，为了判断选择培养基是否起到了对纤维素分解菌的选择作用，需要设置的对照是(

) A．未接种的只有纤维素为唯一碳源的培养基

B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

D．接种了的只有纤维素为唯一碳源的培养基

4．通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行(

) A．发酵产纤维素酶的实验

B．提取纤维二糖的实验

C．浓缩纤维素分解菌的实验

D．提取葡萄糖的实验

5．下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答下面有关问题：

土壤取样→梯度稀释→将样品接种在鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落，统计并计算每克样品中的细菌数

(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_________________________________________________________________________。

(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的选择培养基，成分如下，整个实验过程严格执行无菌操作。

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏、水解酪素

如果将其中的纤维素粉换成__________________，菌落数____________________，即可说明选择培养基的作用。

(3)本实验宜采用__________________法而不使用平板划线法，原因是该法可以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数。

含量/g 5 1 1.2 0.9 0.5 0.5 适量

答案精析

一、基础梳理

1．(1)①葡萄糖

②根、茎、叶

(2)②C1酶和CX酶

葡萄糖苷酶

2．(1)刚果红染色法

①微生物

刚果红

②倒平板

(2)纤维素分解菌

问题探究

1．(1)纤维素酶中的C1酶、CX酶使纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

(2)设计对照实验。取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。

2．(1)筛选目的菌株应该到有利于目的菌株生长的环境中寻找。

(2)将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。

3．(1)液体培养基，因为配方中无凝固剂。液体培养基与微生物的接触更密切，微生物更容易从培养基中获得营养物质，因此可以快速增加微生物的浓度。

(2)有选择作用。本配方中富含纤维素，更适合能够分解纤维素的微生物大量繁殖。对照实验可以用牛肉膏蛋白胨培养基培养微生物。若选择培养基上微生物数量明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上微生物的数量，则说明培养基起到了选择作用。

拓展应用

1．A

[纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分——C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和CX酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。]

一题多变

(1)能。纤维素分解菌分解纤维素只是为了利用纤维素作为碳源，其他有机物若可提供碳源，也可以生存。

(2)不在细胞中分解纤维素。多数细胞不能直接吸收纤维素，一般来说，纤维素酶都是分泌到细胞外分解纤维素的。

2．(1)纤维素粉

NaNO3、酵母膏、水解酪素

(2)液体

(3)纤维素分解菌

解析

该培养基的主要碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏、水解酪素。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为主要碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。

问题导析

(1)纤维素

纤维素分解菌

(2)琼脂

一题多变

(1)当土壤中纤维素分解菌的浓度很高时，可以省略选择培养这一步骤。

(2)可以提供碳源、氮源和生长因子。

(3)不是，纤维素是主要的碳源，另外，酵母膏和水解酪素也可以提供少量的碳源。

二、基础梳理

1．纤维素

纤维素

梯度稀释

鉴别

透明圈

2．(1)纤维素

(2)纤维素

纤维素分解菌

(4)鉴别

(5)透明圈

3．(1)纤维素酶

(2)液体

固体

(3)滤纸

葡萄糖

问题探究

1．(1)刚果红染色剂。

(2)①鉴别培养基是在培养基中加入某些特定的作用底物和指示剂，观察微生物生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别微生物；选择培养基是在培养基中加入某些物质，以促进目的菌的生长繁殖，同时抑制其他杂菌的生长繁殖。

②选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基一般为固体培养基。

2．方法一更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌。即先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，所显示的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二中有些微生物具有降解色素的能力，它们在生长过程中会降解刚果红，也会使培养基上形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

3．(1)产生透明圈的菌落可能是能产生纤维素酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。

(2)纤维素分解菌分解纤维素产生的纤维二糖和葡萄糖，不能与刚果红形成红色复合物，而出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

(3)分解尿素的细菌能够将尿素分解成氨，加入酚红指示剂后会变红，也会形成以尿素分解菌为中心的红色的圈。

拓展应用

3．C

[刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。]

4．(1)葡萄糖苷

(2)接种环

灼烧

(3)纤维二糖

葡萄糖

倒平板

(4)透明圈

发酵产纤维素酶

葡萄糖

解析

(1)纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)常用的接种工具是接种环，操作时采用灼烧的方法灭菌。(3)刚果红不与纤维二糖和葡萄糖发生反应。(4)刚果红与纤维素反应呈红色，纤维素分解菌产生的纤维素酶会将纤维素分解而不能与刚果红染液反应呈红色，在菌落周围会出现透明圈。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

课堂小结

多糖

葡萄糖苷酶

刚果红染色法

梯度稀释

透明圈

当堂检测

1．B 2．D

[刚果红与纤维素反应形成红色复合物，当有纤维素分解菌生长时，菌落周围的纤维素被分解，形成透明圈。]

3．C 4．A

[为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生的葡萄糖进行定量测定。]

5．(1)根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找

(2)葡萄糖

明显多于选择培养基上的菌落数

(3)稀释涂布平板

解析

(1)选择菌种是分离、纯化、扩大培养细菌的前提和基础，其基本原理就是根据菌株对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。(2)纤维素分解菌的培养，必须在以纤维素为主要碳源的培养基上进行。要想说明选择培养基的作用，需设立对照实验：将纤维素粉换成葡萄糖，进行菌落数比较，可见后者菌落数较多，说明以葡萄糖为碳源的培养基与以纤维素为碳源的培养基在微生物培养中的作用不同。(3)由题意知，本实验不仅要分离出土壤中的纤维素分解菌，同时还要统计每克土壤样品中的纤维素分解菌的细菌数，因此不能用平板划线法接种，而要用稀释涂布平板法接种。因为前者无法统计出每克样品中细菌数。