课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数全国优秀课堂实录

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教学设计

曹丽

一、教材分析与课时安排

“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”是人教版高中生物（选修1）专题2“微生物的培养与应用”的第二个课题。此前，学生已学习了微生物的实验室培养的的基本知识，包括培养基、无菌技术、接种方法（平板划线法和稀释涂布法）等。本课题在分离和纯化微生物的实验操作的基础上，研究培养基对微生物的选择作用，并测定其数量。其中既有关于特定菌株的选择策略等知识性内容，又有土壤溶液的稀释、菌落数量统计等操作性内容，因此难度较大、探究性较强，是培养学生设计实验、动手操作等科学探究能力，提高生物科学素养的好素材。

由于高二学生刚接触微生物的实验操作，很多知识和概念还比较模糊，本课题教学实施中的关键在于：①处理好知识性内容与操作性内容的关系，要让学生理解特定菌株的选择策略，并学习有关的实验方法和操作程序;②

处理好课堂与课后的关系。本课题的学生实验操作时间不长，但是操作前要制备培养基、对培养基和其他操作用具进行灭菌，操作后的培养时间和对微生物进行观察则需要较长时间，因此需要教师精心设计教学程序，统筹安排教学时间。

根据这一特点，本课题教学可分3个课时进行，第一课时是知识性内容的讲解和掌握，第二和三课时是进行实验操作，包括实验前的准备工作、实验操作、操作后微生物培养过程中的观察和计数。

二、教学目标

1.知识目标

了解课题背景，弄清研究思路，说出选择性培养基的用途，简述微生物的分离和计数的实验原理和方法。

2.能力目标

学会采集土壤，制备土壤样本稀释液，用稀释涂布法将菌样液接种到固体培养基平板，统计微生物数量。学会设计对照实验和平行重复实验。

3.情感目标

体会在实验活动中合作学习的有效性，养成严谨的科学态度。形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯。

三、

教学流程

课题背景

尿素[CO(NH2)2]是—种重要的农业氮肥，但是，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中细菌将尿素分解为NH3和CO2之后，才能被植物吸收利用。

土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，化学反应式如下：

本课题以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到两个主要目的：1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

研究思路

（1）

筛选菌株

实例

以PCR技术为例，引导学生探究问题的解决方法。

PCR技术：全称DNA多聚酶链式反应，是一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。这种酶要能忍受93℃左右的高温。

提出的问题—如何寻找耐高温的DNA聚合酶？

解决问题的思路—寻找耐高温环境。

原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。

获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

实验室微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

本课题使用的培养基

（1）让学生分析本课题使用的培养基成分，回答问题。

KH2PO4

1.4g

NaHPO4

2.1g

MgSO4 .7H2O

0.2g

葡萄糖

10.0g

尿素

1.0g

琼脂

15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

碳源：葡萄糖、尿素；氮源：尿素。

问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。

（2）共同归纳选择培养基概念

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

（3）举例说明选择培养基作用

加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。

不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。

（2）

统计菌落数目

1.显微镜直接计数

原理：利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

每一个大方格边长为

1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

做法：

1．镜检计数室。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数；

2．加样品。将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的酵母菌悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，多余培养液可用滤纸吸去；

3．计数。稍待片刻（约5min)，待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察、计数并记录。

4. 计算。细胞总数/ml=每个小方格内细胞个数×400×104×稀释倍数

优缺点：优点--能统计微生物的实际数目。缺点--不能区分死菌和活菌。

2.间接计数（活菌计数法）

（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

（2）计数：

【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（

）

89

A.2.34×10

B.2.34×10C.234

D.23.4 【答案】B。计算公式：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M ，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mＬ)，M代表稀释倍数。

【例2】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。

【例3】在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有问题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质，导致其他杂菌生长。

但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响因素吗？

方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

(3)计数原则：为保证结果的准确性，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数；要设置重复组（每个稀释梯度涂布3个平板作为重复组，至少要有2个平板的菌落数相接近）；要设置对照组（对照组为空白培养基或者加入等量无菌水的培养基）。

(4)结果：统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

（3）

实验设计

1.土壤取样；

2.制备培养基；

3.样品稀释、取样涂布；

4.微生物的培养、观察并记录结果；

5.细菌的计数。

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

取土样用的小铁铲和信封使用前都需要灭菌。回实验室后，去除土壤中的植物枯枝败叶及其他杂物，用托盘天平称取样品10 g，加入到盛有90 g无菌水的锥形瓶中，震荡

10 min，即制得101土壤溶液，制备完成后可置于冰箱冷藏室内备用（1～2 d）。

2.制备培养基（准备工作，提前完成）

牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基（制备以尿素为唯一氮源）是否起到选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此可以选择较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。

【资料】

牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加热溶解后，加水定容至1 000 mL。分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。

尿素固体培养基的配方：葡萄糖10 g，尿素1 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4

2.1g，MgSO4・7H2O 0.2 g，琼脂15 g，加热溶解后定容至1 000 mL，分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。

将上述分装好的两种培养基、装有9mL 蒸馏水的带棉塞试管、装有90 mL 蒸馏水的250 mL锥形瓶、包装好的培养皿进行高压蒸气灭菌。 3.样品稀释、取样涂布

原理

因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。测定土壤细菌数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。

操作

将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。（稀释涂布平板法）（注意做好标记！！）

4.微生物的培养、观察并记录结果

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d；放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7d；而霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4d。

将涂布好的培养皿放在30℃下培养。本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数稳定时的记录作为结果。同时，比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量，并做好记录。观察对照组是否有菌落。

一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。

5.细菌的计数

当菌落数目稳定时，在同一稀释度下，如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 ～300平板，说明稀释比较成功，并能够进行菌落的计数。对这些平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

（4）

操作提示

(一)无菌操作

1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

(二)做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

(三)规划时间

提高效率，在操作时更加有条不紊。

【典型例题】

（2016课标1卷.39）

[生物——选修1：生物技术实践]（15分）

空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室

空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题: （1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。

（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。

（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。

【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨

琼脂（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间（3）污染

不正确

（5）

进一步鉴定

脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

【资料】

微生物将含氮有机物分解产生氨的过程被称为氨化作用。能进行氨化作用的细菌统称氨化细菌。有些氨化细菌能分泌脲酶，可将尿素分解生成氨，为微生物提供氮源，如脲芽孢八叠球菌。

硝化细菌可利用氨氧化过程中释放的能量，将无机物转化成有机物而营自养生活，其中能将氨氧化成亚硝酸盐的称为氨氧化细菌，如亚硝化单胞菌;能将亚硝酸盐氧化为硝酸的是亚硝酸氧化细菌，如硝化杆菌等。 通过观察可知，在培养基上出现了两种不同类型的菌落，一种菌落周围出现了红色圈，另一种则呈现黄色。这说明这些微生物的种类是不同的，菌落周围变红的说明微生物培养过程中产生了碱性物质，而菌落周围变黄则说明产生了酸性物质。